如何把液相做到“打游戏”

xiemufeng

液相色谱仪是药物分析工作者最常用的“一门武器”。本人工作15.5年，深感何时能将液相做到有“打游戏”感觉时，便是到了游刃有余、驾轻就熟的境界。现今的液相软件均已具备了强大的数据处理功能，如能庖丁解牛般使用，便可将此测定做到事半功倍、轻松自如。

一、 水相中的溶质溶解方式
水相中需溶解的无机盐和表面活性剂等固体溶质，建议采用加热法，不建议采用振摇、超声等方式。因此种方式的溶解，溶质可能处于“临界胶团浓度”，其后一旦遇到某特殊情形（如遇有机溶剂、温度剧降等），极易析出少量结晶；而一旦析出，便将损伤仪器和色谱柱，呈现泵头处析出“盐和白粉”的现象。

二、 流动相的配制与使用
1. 恒度洗脱
一定是将水相与有机相混合后、抽滤（使用混合型过滤膜），用一个管路（如A管）泵入仪器，这是使用的原则。切勿因节约有机相、便于摸索色谱条件等原因而使用两个管路（一个纯水相、一个纯有机相）泵入仪器，即便配制了脱气机。因此种情形极易造成水相中盐和表面活性剂的少量析出。
剩余流动相完全可继续使用，密封后放置阴凉处；待下次试验时与新配制的流动相混合后抽滤即可。无需担心发霉、无机盐析出、挥发、比例不准等问题，这些皆为疑神疑鬼的表现。实践是检验真理的唯一标准！实践吧~
2. 梯度洗脱
流动相配制最为科学的方式是：A相为高比例的水相-低比例的有机相、B相为低比例的水相-高比例的有机相（英国药典几乎均如此）；其次为：A相为高比例的水相-低比例的有机相、B相为纯有机相；最不科学的为：A相为纯水相、B相为纯有机相，如既有质量标准采用了此种方式，建议改为第二种或第一种方式，否则基线漂移严重，难以进行稳定的杂质检测。
梯度洗脱结束后，建议经5分钟回到初始状态，再平衡5分钟后开始下一针测定。这10分钟的稳定极为关键。切勿短时间内回到初始状态，会对仪器和色谱柱损伤较大。

三、 色谱柱的安装
标准SOP应为：取A管路放入流动相瓶中→拧松泵头→流速由0ml/min逐渐升至10ml/min，观察尾液是否呈瀑布状流出，持续10秒→拧紧泵头→流动相呈抛射状从安装色谱柱的一端喷出，观测是否呈抛物线状，持续5秒→流速逐步降至1.0ml/min →安装色谱柱，待20秒后，流动相从色谱柱另一端呈泉水状涌出再安装另一端→手握两端螺丝帽，拧紧。
以上安装顺序遵循的是：逐级排放气泡和仪器内存留的洗液，使得安装后气泡极难混入。本人曾试验梯度洗脱连续一周，第一针与最后一针主成分保留时间相差在6秒以内。

四、 试验后色谱柱的清洗
1. 最为常用的C8柱、C18柱
1.1 流动相仅为乙腈-水或甲醇-水时
继续冲洗30分钟，流速1.0ml/min，柱温保持试验时温度，即可。
1.2 水相中有无机盐、表面活性剂或三乙胺、高氯酸等物质时
先采用纯水（或含有2%甲醇），冲洗A管路（试验采用哪个管路，就要从头到尾冲洗该管路），时间30分钟（如流动相中有表面活性剂，适当增加时间），流速1.0ml/min，柱温可较试验温度高出5~10℃；随后更换成20%甲醇再冲洗30分钟，流速1.0ml/min，柱温箱加热装置关闭。结束后取下色谱柱放置阴凉处。
很多同仁其后采用高比例的甲醇冲洗，实属画蛇添足，导致残余的有机相中水相遇到高比例的甲醇后析出少量盐和表面活性剂，从而在泵头上、色谱柱中析出，也导致了色谱柱寿命大为缩短。本人曾使用过一根约2000元的色谱柱，正着用了四年、倒着用了两年（倒着用测非有关物质）。
2. 其他类型色谱柱
查询获取如何科学合理地使用与清洗保存该类型色谱柱的方法，切勿盲动，否则导致色谱柱性能急剧下降。

五、 试验顺序
工作流程应如下进行：
(1) 0~2小时 配制流动相、对照品和供试品溶液等，切勿催促昨日试验同事。
(2) 2~3小时 采用A管路注入流动相（B、C、D管路一般不用，除非梯度洗脱才用到B管路），平衡1小时。如流动相中有表面活性剂，建议前一晚小流速过夜，第二天上班后将流速增至1.0ml/min，平衡1小时后即可开始做试验。
(3) 3~5小时 测定空白溶剂，一定要做到基线不漂移后方可开始测定。所谓“不漂移”，通常系指以1.0%自身对照溶液主成分峰高约20%高度来设定的视野范围观察所得，切不可设定得过小，使得杂质峰显得很突兀、基线抖动得很厉害，弄得人很担心。
(4) 5~8小时 配制完所有样品，预试了对照溶液和供试品溶液，设定好自动进样程序，程序最后一针设定为小流速过夜，紫外灯关闭。切勿设定为切换至B管路洗脱，此举得不偿失。
(5) 9~24小时 放心回家，让仪器自动进样，除非不稳定的样品（配制一份测定一针）。充分利用下班后的16小时，做到从容不迫、镇定自若。如单位还无自动进样装置，建议向领导申请购买，因一台自动媲美三台手动。
(6) 第二天0~0.5小时 检查并计算昨晚试验结果，如发现不良记录，将流速增至1.0ml/min，平衡30分钟后，测定重新配制的该份样品即可（同时回校对照一针）。无需全部重新测定，不要过度谨小慎微。
(7) 第二天0.5~2.0小时 如上冲洗色谱柱，交给其后试验同事。

六、 液相软件的使用
现今几大主流品牌的硬件性能已相差无几，主要还是软件的设计是否能使操作者得心应手、随心所欲。
建议掌握各软件的批处理、编辑样品处理模板等功能，做到一劳永逸，让软件充分为工作所用。“磨刀不误砍柴工”：本人曾用20分钟完成500个溶出度样品数据处理，做出溶出曲线图。体会一下~

七、 其他
1. 如需使用正相系统，一定要单独采用一台仪器（如二手的、较为破旧的、淘汰的等），切勿采用异丙醇转换，此举对仪器损伤极大，等于“自杀”。
2. 正相所使用的流动相（如正己烷、环己烷等），无需抽滤，混匀超声后即可使用，“大道至简”。
3. 柱温箱必须配制。如欲经济，可购买国产柱温箱。
（欢迎众人补充完善……）
                                                                                                                                    2013年12月

幻影

欢迎谢沐风老师！

红茶.

假期都不闲着啊。

北重楼

感谢谢沐风老师的指导

岁寒三友

学习了 谢谢分享哈

anson112

谢谢楼主分享！

yonyou

学习了，谢谢楼主分享！

289112980

老师辛苦了，值得我好好学习。哈哈

lovejob

这个效率是不是有点太低了呢？一天只能进一个样品，而且还是全自动进样，如果没有全自动警进样，估计要两天

大呆子

lovejob 发表于 2015-5-3 11:44
这个效率是不是有点太低了呢？一天只能进一个样品，而且还是全自动进样，如果没有全自动警进样，估计要两天 ...

这个应该是指一个非常正式的检测周期，进行生产过程监控，我个人认为不一定非要这样严谨，除非复检。

胡光磊

热爱是最好的老师，只有喜欢这个仪器，就会全身心地投入，所以工作就变成了乐趣，做液相也就象打游戏一样快乐

巴西木

我非常同意谢老师的观点，送朵鲜花鼓励一下.业精于勤！

石头968

熟能生巧，游刃有余

心里有数

学习了，O(∩_∩)O谢谢

jacob3263313

高手，在民间，16年液相，你得淘汰了多少台啊

syhorchid

谢谢分享

巴西木

梯度洗脱结束后，建议经5分钟回到初始状态，再平衡5分钟后开始下一针测定。这10分钟的稳定极为关键。-----------我做头孢累产品（原料药）的有关物质时，经常在结束一阵后，必须进一阵流动相运行相同的时间，否则对第二个样品的峰形和结果影响很大，不知道头孢累产品的进针后的残留为什么影响这么大？@xiemufeng     

julia朱玉姣

谢谢谢老师分享宝贵经验。我比较外行，弱弱地问个问题：如果我的仪器专门做同一种样品同一个系统（样品很多），一般要多少时间让仪器或柱子休息（比如清洗柱子、停机）？这个有什么经验时间么？还是根据自己的样品和系统来确定？

hongwei2000

理论家啊，呵呵
只是个人觉得只是理论还不太完善
一、胶束是表面活性剂的特性，是由于它具有一个极性头和一个长非极性尾的原因，稍微学点物理化学或者制剂学的人可能都会知道，但要说无机盐，例如磷酸盐之类的还有这种性质，不知道是什么理论基础，我孤陋寡闻，没听说过也没见过。
二、1 不说GMP要求的有效期，单单说才菌、挥发等现象就是事实，没见过的可以在实验室放一瓶，尤其是低有机相比例的，在夏天；比例试一下对比例敏感的就知道了，例如用氨基柱测糖看保留时间的漂移。
四、1.2 好像有很多反相色谱柱是不可以耐纯水的，这无论是在色谱丛书还是药典中都有描述。当然现在是有能耐纯水的柱子，但你要了解或咨询厂家才好，否则小心你的柱子！至于说高比较甲醇，往往你是必不可少的，因为你低比例往往是除不掉柱中残留的非极性物质的，当然前提是有低比例甲醇（一般不少于5%）先冲洗一段时间（建议不少于20倍柱体积，不能简单的按时间计算，柱容量是不同的），可以使用梯度甲醇的方法来洗脱。

hongwei2000

巴西木 发表于 2015-5-3 17:21
梯度洗脱结束后，建议经5分钟回到初始状态，再平衡5分钟后开始下一针测定。这10分钟的稳定极为关键。------ ...

与是否是头孢没有关系
可能是你方法与你工艺不适应
也就是可能有杂质在梯度系统中并没有被洗脱出来造成的
而且中国药典中没有规定色谱柱的信息
而这一信息对于梯度是非常关键的
这也是一种可能性
还有就是中国药典的梯度方法往往梯度差比较小
也会造成弱极性杂质不易洗脱
而国外药典的方法往往是梯度差比较大
而且随后带一个快速回归
再有几分钟的平衡时间
出现你说的这种情况就非常少见了