聚合酶链式反应扩增DNA

wangsheng0726

      

聚合酶链式反应扩增DNA

      

【实验目的】标本检测,熟悉通过聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，简称PCR）体外扩增特定DNA片段的技术原理和实验方法。

      

【实验原理】

      

PCR是在模板DNA、引物和4种脱氧核苷三磷酸（dNTP）存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的酶促DNA合成反应。反应分为三步：（1）变性（denaturation）: 双链DNA在高温条件下解开成单链；（2）退火（annealing）:当温度降低时，引物与单链模板DNA 的特定序列结合；（3）延伸（extension）: DNA聚合酶以单链DNA为模板，按照碱基互补配对原则，从引物的3’端按照5’→3’方向合成新链。以上述三步为一个循环，每个循环合成的DNA都可作为下一个循环的模板，经过多个循环后，特定的DNA片段数量可以增加到2n倍。基金论文，你提供实验材料，我免费给你做实验，成果归你享有,本实验根据噬夏孢欧文氏菌（Erwinia uredovora）基因组中的crtE序列（crtE编码牻牛儿基牻牛儿焦磷酸合成酶，参与类胡萝卜素的合成），设计一对引物，从基因组中扩增该基因。

      

【器材与试剂】

      

1．实验仪器  PCR仪，微量移液器，电泳仪，DNA电泳槽，紫外分析仪

      

2．实验试剂  Taq DNA聚合酶，PCR缓冲溶液（10×），10 mmol/L dNTP 混合液，λDNA/EcoR I, Hind III，琼脂糖，DNA载样缓冲溶液(（10×），溴化乙锭染色液，TAE缓冲溶液（50×）Nature biotechnology的CRISPR/cas9

      

1． 实验材料  噬夏孢欧文氏菌基因组DNA，PCR专用薄壁管

      

引物1：5’-GAATTCCATATGACGGTCTGCGCAAAAAAAC-3’

      

引物2：5’-ATTCTCGAGTTAACTGACGGCAG-3’

      
      

【实验步骤】

      

1．在0.2 mL的PCR薄壁管中加入下列组分配成20 μL反应体系：2 μL PCR缓冲溶液（10×），1 μL引物1（0.5 μmol/L），1 μL引物2（0.5 μmol/L），1 μL dNTP 混合液，1 μL Taq DNA 聚合酶，1 μL噬夏孢欧文氏菌基因组DNA（约10 ng），13 μL 无菌双蒸水。

      

2．PCR参数设为：94℃预变性5 min，94℃变性45 s，52℃退火45 s，72℃延伸1 min，共进行35个循环，最后72℃保温10 min。

      

3．用1×TAE配制1%琼脂糖凝胶。

      

2． 在PCR反应体系中加入2 μL载样缓冲溶液，混合后，上样电泳。

      

3． 将凝胶用溴化乙锭染色30 min，于紫外分析仪内观察结果。

      

【注意事项】

      

1．本实验PCR反应体系应充分混合均匀。

      

2．应根据选购Taq DNA 聚合酶公司提供的使用说明，选择合适的PCR缓冲溶液，有的缓冲液中添加了Mg2+，有的则没有。