动物疫苗的乳化

上林苑监

动物疫苗的乳化

  动物疫苗的乳化是指将抗原液分散在油佐剂中所形成稳定的异源系统，注入动物体内后，能非特异性地增强动物机体对抗原的特异免疫应答，并延长免疫持续期。由于油佐剂能将抗原物质吸附或黏着，注入动物机体后可较久地存留在体内，持续地释放出抗原物质来不断刺激机体的免疫系统，从而能持久地提高抗体效价，提高疫苗的免疫效果。因此，人们不断研究动物疫苗的乳化效果和新型油佐剂，以便获得更有效、更安全和更稳定的疫苗。

一、动物疫苗的乳化及佐剂

1.1动物疫苗的乳化

  油佐剂疫苗是指抗原液体或微粒（滴）（分散相或内相）借助乳化剂，在机械力的作用下，分散悬浮于不相溶的油佐剂液体（连续相或外相）中所形成相对稳定的分散体系。

1.2动物疫苗乳化剂

  两个不相混容的纯液体不能形成稳定的油乳剂，必须要加入第三组分（起稳定作用）—乳化剂，以降低体系的界面能。乳化剂属于表面活性剂，其主要功能是起乳化作用，才能形成油乳剂。例如，将注射用白油和抗原液放在试管里，无论怎样用力摇荡，静置后都会很快分离。但是，如果往试管里加一点乳化剂，再摇荡时就会形成象牛奶一样的乳白色液体。乳化剂指动物疫苗中分散相与连续相两相间的界面活性物质，可促进和稳定两种互不相溶物形成乳剂，如弗氏佐剂中的羊毛脂，油佐剂中的Span-80、Arlacel-80、Tween-80等。动物疫苗的乳化见图1。

二、动物疫苗的剂型

  通常动物疫苗的乳化过程中一相是水相抗原和极性小的有机液体油相油佐剂，习惯上统称为“油”。根据内外相的性质，油乳剂主要有三种类型，一类是油分散在水中，简称为水包油型油乳剂，用O/W表示；另一种是水分散在油中，简称为油包水型油乳剂，用W/O表示，还有一种复合油乳剂，它的分散相本身就是一种油乳剂，如将一个W/O的油乳剂分散到连续的水相中，而形成一种复合的双相W/O/W型油乳剂。不同的动物疫苗剂型的特性见表1。

2.1 动物疫苗剂型检测

  动物疫苗不同的剂型有不同的特点，根据不同的免疫要求、免疫动物、免疫途径和抗原类型综合选择理想的剂型。水包油(O/W)安全性高，但扩散快，佐剂活性较低；油包水（W/O）能在肌肉注射部位贮存相当长一段时间，能给抗原提供短期及长期的免疫增强作用，但是刺激性大，安全性不高；W/O/W安全性，佐剂活性介于以上两者之间。

一般根据不同剂型的不同特点，可以用下列方法加以简要鉴别：

2.1.1稀释法

  乳剂易被与外相介质相同的液体稀释，而难溶于与内相相同的介质。稀释法，也称小液滴实验，就是利用这一特点，用水或油对动物疫苗做稀释试验，来鉴别动物疫苗的基本剂型，见图2。能与水相容的则是水包油(O/W)，而浮在水的表面（见图2B）或能溶于油的则为油包水（W/O）。W/O/W，在用稀释法检测剂型时，W/O/W同O/W一样，都能溶于水，但是前者液滴部分自我稀释，扩散速度相对较慢，并使水呈乳白色（见图2C），而水包油型乳液在滴入冷水中立即散开，与水溶于一体(见图2A)。

2.1.2镜检法

  镜检（10×100倍）能观察到不同剂型，具体见图3：其中图A、B、C分别为O/W,W/O/W,W/O型乳剂。同时利用显微镜还能定性观察到乳剂粒径大小，均一性，及双相所占比例大小。

2.1.3电导法

  一般油类物质的导电性差，而水类物质是一种良好的导电载体。因为不同剂型动物疫苗的外相或为水、或为油，故可利用电导法来测量其剂型。测量电导的仪器为电导仪。或可以设计一个简单的回路，两节电池，一个小灯泡，用导线相连，但设计成开路，将未接合导线两端插入溶液中，若灯泡亮，则有O/W乳剂，反之为W/O乳剂。用电导仪直接测电导率也能够区别剂型，如油包水W/O电导率约为0，水保油包水W/O/W约为5,水包油O/W约为10。

2.1.4染色法

   通常使用的水溶性染料为甲基蓝，甲基蓝亮蓝FCF等，油溶性的染料为苏丹红Ⅲ。针对O/W或W/O的外相分别为水或油，分别向其中投入水溶性或油溶性染料，若水溶性染料扩散溶解，整个乳液呈现水溶性燃料的颜色，则为O/W乳剂，反之则为W/O。

2.2油乳剂动物疫苗的光学性质

  油乳剂动物疫苗的外观一般常呈乳白色不透明液状，油乳剂之名即由此而得。油乳剂的这种外观是与分散相粒子之大小有密切关系。由胶体的光学性质可知，对一多分散体系，其分散相与分散介质的折光率一般不同，光照射在分散微粒（液滴）上可以发生折射、反射、散射等现象。当液滴直径远大于入射光的波长时，主要发生光的反射（也可能有折射、吸收），当液滴直径远小于入射光波长时，则光可以完全透过，这时体系呈透明状。当液滴直径稍小于入射光波长时，则有光的散射现象发生，体系呈半透明状。一般油乳剂的分散相液滴直径的大小大致在0.05－1.0μm的范围，可见光波长为0.40－0.76μm，故油乳剂中的反射较显著，因而一般油乳剂是不透明的乳白色液体。这就是油乳剂的微粒大小与外观之关系。

三、动物疫苗佐剂

  佐剂是协助激活先天免疫系统，让机体误认为疫苗是真的外来威胁的病原因此发动抵御功能做出免疫应答。目前常用的油佐剂是指一类由油类物质和乳化剂按一定比例混合而形成的佐剂。动物疫苗佐剂见表2。

3.1合成佐剂

  目前最广泛使用的油为白油。一方面白油具有极低的渗透性，和很好的封闭性。这能使油乳佐剂在注射部位发挥贮库效应，延长抗原在体内的停留时间，使抗原具有缓释性，并能防止体液中酶的分解，从而持续刺激机体，增强抗原的免疫原性。Drakocel-6 VR、Marcol-52、Lipolul-4等均是国外常用的白油。SEPPIC佐剂、Montanide ISA50、ISA206均是基于矿物油的佐剂，佐剂活性强。另一方面，白油在机体组织内因不能代谢而长期存在，造成局部组织损伤，能引起注射部位的毒副反应。目前国内大多数疫苗厂家采用法国SEPPIC油佐剂，少数疫苗生产商圆环、支原体、细小病毒等疫苗中用赛德奥生物科技MERCKINADE206和MERCKINADE 25。

3.2可代谢性油佐剂

  另外一类很重要的油即为代谢性油，包括植物油和动物油，与白油相比有着能被机体代谢，局部反应小的优势，但大多数种类受到原料价格较高、易氧化或佐剂活性较差等限制。佐剂65是以花生油为油相制成的W/O型佐剂，MF59是以角鲨烯为油相制成的O/W型佐剂，而SAF则是以角鲨烷为油相制成的O/W型佐剂。这些乳化佐剂，佐剂效应高，安全性好。目前，MF59佐剂由于其高佐剂效应及低毒性，已在欧洲20多个国家被批准用于人用疫苗。

四、动物疫苗乳化制备

油乳剂的制备在确定其合理的配方后，其乳化技术也是极其重要的。疫苗乳化的制备主要是混合技术。虽然混合技术比较单纯，但作为疫苗，要求有多种功能和性质，要制备出性质优良和稳定的疫苗，并不是一件简单的事。油乳剂是由水相和油相所组成的，动物疫苗乳化的制备一般是先分别制备出水相和油相，然后再将它们混合乳化。

4.1 乳化方法

传统的乳化方法需要将乳化剂加入的矿物油中制备油相，但目前大多数均采用商品油佐剂如法国SEPPIC油佐剂和赛德奥生物科技油佐剂，直接进行一步法乳化，无需添加乳化剂。

4.1.1油相的制备，将商品化的油佐剂如，116℃高压灭菌30min，即为油相。

4.1.2水相的制备，取抗原液（通常先灭活）加入2% Tween-80混匀即为水相。

4.1.3按油相与水相1:1(v/v)混合乳化，即将油相置组织捣碎容器内，慢速搅动油相，同时缓慢加入水相进行乳化，最后高速乳化成W/O型油乳剂抗原制剂，在乳化过程中亦可根据乳剂的粘稠度适当调节油、水相比。

4.1.4或者将粘稠的W/O型油乳佐剂抗原制剂再加入2% Tween-80生理盐水后继续乳化成双相抗原制剂。

4.1.5也可直接制成双相油乳佐剂抗原制剂。如SEPPIC Montanide ISA 206 VG和赛德奥生物科技MERCKINADE206和 MERCKINADE 25。可一步法乳化，与抗原液混合成剂只需要搅拌均匀即自行成剂。

4.2 乳化设备

  制备油乳剂的机械设备主要是乳化机，它是一种使油、水两相混合均匀的乳化设备，目前乳化机的类型主要有：乳化搅拌机、胶体磨、高压均质机和高剪切乳化均质机。依据油乳佐剂和抗原制剂特性选择适当乳化设备。

4.3 影响疫苗乳化效果的因素

4.3.1乳化设备

  乳化机的类型及结构、性能等与油乳剂微粒的大小（分散性）及油乳剂的质量（稳定性）有很大的关系。水包油O/W和双相水包油包水W/O/W如SEPPIC Montanide ISA 206 VG大多数采用低剪切多层搅拌的双层乳化罐，其设备参数：乳化温度批次量、搅拌桨直径、搅拌速度、罐体高度、罐体直径和罐体比例等。而油包水W/O如SEPPIC Montanide ISA 50 V2一般采用低剪切预乳化和高剪切乳化，有批量流程的顶部搅拌和底部搅拌、在线流程的循环和转移等高压均质工艺设备，其中批量流程顶部搅拌和底部搅拌的工艺设备容易操作，重复性好比较稳定，但大规模生产中因消耗高能量而费用高；在线流程的循环工艺设备和转移工艺设备不易清洁灭菌，而且通常过程比批量流程长，其设备关键参数：高剪切定子-转子，高剪切搅拌几何、涡轮速度和搅拌周期；设备均质的能力如罐子几何体积，搅拌设备的速度，水相加入的速度等；预乳化的步骤等。

4.3.2温度

  乳化温度对乳化好坏有很大的影响，但对温度并无严格的限制，如若油、水皆为液体时，就可在室温下凭借搅拌达到乳化。一般乳化温度取决于二相中所含有高熔点物质的熔点，还要考虑乳化剂种类及油相与水相的溶解度等因素。另外在乳化过程中如粘度增加很大，所谓太稠而影响搅拌，则可适当提高一些乳化温度。若使用的乳化剂具有一定的转相温度，则乳化温度也最好选在转相温度左右。乳化温度对油乳剂微粒大小有时亦有影响。实际经验证明SEPPIC MONTANIDE ISA 206 VG的乳化温度为32~35℃，一般将水相抗原和油相佐剂（灭菌）分别加热到32~35℃，搅拌时将抗原加入到佐剂中。对热敏感的抗原，抗原低温抗原（4~8℃）加到高温佐剂中（40-45℃）搅拌乳化，控制搅拌容器的温度在32~35℃，乳化结束后需要不搅拌降温到12℃。而油包水W/O剂型因在高速、高压均质高剪切乳化高速产热避免高温，乳化温度应控制在25℃以下。

4.3.3乳化时间

  乳化时间显然对油乳剂的质量有影响，而乳化时间的确定，是要根据油相水相的容积比，两相的粘度及生成油乳剂的粘度，乳化剂的类型及用量，还有乳化温度，但乳化时间的多少，是为使体系进行充分的乳化，是与乳化设备的效率紧密相连的，可根据经验和实验来确定乳化时间。如用均质器（3000转/分钟）进行乳化，仅需用3－10分钟。在双相水包油包水W/O/W低剪切乳化时乳化时间与搅拌速度和乳化体积匹配乳化，如批次量大搅拌速度低，乳化搅拌时间长。

4.3.4搅拌速度

  乳化设备对乳化有很大影响，其中之一是搅拌速度对乳化的影响。搅拌速度适中是为使油相与水相充分的混合，搅拌速度过低，显然达不到充分混合的目的，但搅拌速度过高，会将气泡带入体系，使之成为三相体系，而使油乳剂不稳定。因此搅拌中必须避免空气的进入，真空乳化机具有很优越的性能。双相水包油包水W/O/W佐剂如SEPPIC Montanide ISA 206和赛德奥生物科技MERCKINADE 206油佐剂在混合乳化时避免高速、高剪切及高压均质，一般采用低剪切乳化搅拌，并且不同的生产量乳化罐容积匹配不同的搅拌速度，搅拌速度一般在80rpm~500rpm之间。油包水W/O油佐剂一般采用100rpm低剪切预乳化后高剪切乳化，转速一般在3000rpm~14000rpm之间，不同的工艺、不同的批量及抗原加入速度选择不同的高剪切转速。

五、动物疫苗的稳定性

5.1 动物疫苗的稳定

  动物疫苗乳化后形成油乳剂，动物疫苗的稳定是指疫苗油乳剂状态和性质在一定条件下（时间、温度等）不发生变化或无显著变化。动物疫苗的稳定性是指疫苗在指定的时间内阻止物理、化学性质变化的能力。由于油乳剂系自身热力学不稳定性，在乳化工艺上尽管采取很多措施维持其动力学稳定性，使油乳剂能较长时间（几个月到一年）或在较苛刻条件（高温、低温等）下稳定，但在实际工艺中还是不够达到理想的稳定状态，所以对乳化后的乳剂进行乳化效果和稳定性测试。

5.2 动物疫苗稳定的原因

油乳剂动物疫苗之所以能够稳定存在，主要是在油乳剂制备的同时加入了乳化剂作用结果，包括：①降低油乳剂内相在外向中高度分散后的表面能，主要通过乳化剂在油-水界面的吸附来实现；②在内相液滴外周围形成高度封闭层，主要通过油-水界面形成楔形定向膜来实现；③形成了内相液滴聚结、融合的屏障，这主要通过靠高的外相黏度来增大内相液滴运动阻力，靠外相中柔和高分子化合物的缠绕屏蔽作用；④内相表面荷电形成了厚的扩散双电层和高的ξ电位；⑤乳化剂分子在内相液滴表面的快速、高密度吸附，可使“金蝉脱壳”的内相液滴再次形成屏蔽壳。一个好的乳化剂能够快速的吸附到油-水界面上，以降低界面表面张力并促进新的界面的形成与稳定，避免分散相液滴的重新聚结。

5.3 动物疫苗不稳定的表现形式

油乳剂的稳定是相对的，不稳定是绝对。油乳剂的不稳定表现形式很多，主要有聚结、絮凝、分层、破乳和相的转变等。油乳剂的分散相小液珠聚集成团，形成大液滴，最终使油水两相分层析出的过程。破乳是油乳液动物疫苗内相和外相完全分离的过程。分层是由均匀乳状液分为两层乳状液的过程。乳液在不发生油水分离的情况下由O-W转变为W-O型，或由W-O型转变为O-W型的现象被称为相转变。破乳后的油乳剂疫苗降低或失去免疫保护，而且会引起不良反应。在实践中搞清造成动物疫苗不稳定的因素主要是物理因素还是化学因素，对正确地选择改善动物疫苗稳定性措施很重要。

5.4

动物疫苗乳化效果及稳定性的常见评价指标

乳液需要一段时间稳定，因此乳化效果及稳定性检查一般在乳化的第二天进行。

5.3.1动物疫苗剂型检测

稀释法测试疫苗剂型，又称小液滴试验，乳液易被与外相介质相同的液体稀释，而难溶于与内相相同的介质。用吸管吸取适量的疫苗，滴入1-2滴乳液到盛有纯水的烧杯中，观察疫苗小液滴在纯水中的分散情况，来鉴别动物疫苗的剂型。液滴停留在水面上是油包水W/O乳液，液滴扩散到水中是水包油O/W乳液，液滴一部分停留在水面，一部分扩散到水中是水包油包水W/O/W乳液。

5.3.2分层率、分层速率和生存时间

将乳化的疫苗分装至玻璃瓶中密封后，分别放置在4℃、20℃和37℃下存放，逐日观察，观察疫苗是否有分层、沉淀和破乳等情况，计算出疫苗的分层率和生存时间，生存时间越长，形成的油乳剂越稳定。动物疫苗分层程度可用已分离的液层厚度占油乳剂总厚度的百分数表示，此即分层率。油乳剂分层的快慢即分层速率。油乳剂分层率和分层速率小者比大者稳定性好。

5.3.3液滴大小及分布

在光学显微镜或粒度分析仪下观察动物疫苗分散相液滴大小及分布。液滴分散度越高，直径越均一，稳定性越好。

5.3.4变流能力

通过用Brookfield DV+黏度计测定疫苗的黏度，用注射器活塞上置以标准重物（3.306kg），检查将10ml乳剂从注射器针头21G(0.8mm)/25mm完全排空所需要的时间，此法模拟疫苗注射时粘度大小影响带来的操作的难易程度。SEPPIC Montanide ISA产品乳剂流动能力见表3。

5.3.5破乳电压

将W/O型的油乳剂放入两个加直流电的极板间，逐渐加大直流电压，当电压大到一定程度时，电流击穿油乳剂的油-水接面膜，分散相液滴“破壳而出”，发生聚合，进而破乳，油乳剂导电所对应的电压，即油乳剂的破乳电压。破如电压越高，说明W/O型的油乳剂越稳定，此法不适于O/W油乳剂。

5.3.6离心分离法

在离心力作用下油乳剂分层与否及分层轻重，是衡量动物疫苗稳定性的最简单而快捷的方法。可测定一定的时间内、一定的转速的离心条件下油乳剂状态变化或发生一定程度油水分离所需的时间，分层需要时间越长的油乳剂稳定性越好，分层量多的油乳剂稳定性差。具体操作方法见现行《中国兽药典》。

  佐剂被认为是和抗原联合以后可以加强对该抗原免疫反应的物质，油佐剂是目前动物疫苗配制中使用最为广泛的佐剂。乳化均质工艺对疫苗产品的影响主要表现在疫苗的物理性状方面。选择理想的油佐剂，合适的水相油相的配比、混合均匀程度、混合物的温度及乳化时均质机的压力等，并在实际生产中不断调整各个参数，找到最佳的参数组合，生产出安全的、有效的、稳定的、易于使用操作和经济的疫苗。

疫苗佐剂

   现代畜牧动物疾病，预防已经成为主方向。而疾病的预防可以通过消毒、免疫等方法进行。疫苗，富含抗原物质，是接种动物后可刺激机体产生特异性免疫力的生物制品。疫苗接种成功与否受不同因素的影响，主要有制备抗原的方法、接种动物的种类、佐剂等。本文笔者主要对免疫佐剂的作用机理及前景展望做如下论述。

一、佐剂作用机理

佐剂，一类可结合抗原并且可以非特异性增强机体免疫反应的物质。起初，人们认为免疫佐剂能够非特异增强机体对抗原的特异性免疫应答反应的机制是“仓库”效应，即在疫苗免疫反应过程中，佐剂起到储存抗原的作用，然后慢慢释放抗原达到持续长久刺激机体的免疫系统的作用。最近研究发现，免疫佐剂也可以对递呈抗原的树突状细胞产生影响，进而增强免疫应答反应和有效的记忆免疫反应。在机体中，树突状细胞充当“哨兵”的角色，其通过监测机体免疫环境而识别机体内坏死细胞、机体受伤后释放的细胞因子、细菌、病毒等危险信号。这些危险信号都能够激活树突状细胞，进而促进从淋巴结中通过淋巴管迁移出来的带有相应受体的淋巴细胞产生初次免疫应答。有部分免疫佐剂，其模拟危险信号的能力与其效果直接相关。因为，这些危险信号的产生伴随着机体的损伤，所以在注射部位或者整个生物体内都会引起炎症反应。还有些佐剂可以诱导生物机体分泌不同种类细胞因子，进而控制或改变生物机体对抗原的免疫反应类型。

二、常用的不同类型佐剂

2.1铝盐佐剂

铝盐佐剂是一类应用很广泛的佐剂，常使用的主要有氢氧化铝明胶、明矾、磷酸三钙等。铝盐佐剂是典型的短期贮存库，其能将抗原包裹于注射部位，不易因肝的清除作用而丢失；铝盐佐剂也能够激活补体，促进巨噬细胞分泌促炎症因子IL-1β、IL-18，还可以增强DNA疫苗诱导的Th2免疫应答，并可以使DNA疫苗的免疫反应原性由Th1应答为主转为Th2应答为主。

2.2油乳佐剂

油乳佐剂是将油类物质和乳化剂按一定比例混合而成的一类佐剂，传统剂型分为两种：水包油型乳剂和油包水型乳剂。其中最为著名的油包水型乳剂为弗氏佐剂（FA），该佐剂是由矿物油（石蜡油）、乳化剂（羊毛脂）和杀死的分枝杆菌组成。若这三种成分在佐剂里俱全,则该佐剂被称为弗氏完全佐剂（FCA）,缺少分支杆菌的佐剂被称为弗氏不完全佐剂（FIA）。弗氏完全佐剂属非常强效的佐剂，能够刺激机体产生很强的体液和细胞免疫，但毒性较大。FIA毒性比FCA小，但活性不如前者，属于典型的只诱导Th2型细胞因子诱生抗体的佐剂。这两种佐剂稳定性都差，难以长期保存。

2.3细胞因子免疫佐剂

细胞因子（cytokines，CK）是主要由免疫细胞分泌的异源性蛋白或糖蛋白，可结合在靶细胞的特异受体上，其在调节先天性免疫和适应性免疫中发挥着关键作用。随着研究的深入，人们发现其可以作为新型分子佐剂增强疫苗效应。目前，研究发现具有免疫佐剂效应的细胞因子有白细胞介素（IL-1、IL-2、IL-12、IL-15、IL-18等）、干扰素（Interferon，IFN）、巨噬细胞集落刺激因子（Macrophage colonystimulating factor,GM-CSF）、肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor，TNF）、趋化因子等。然而，细胞因子佐剂因有一定的剂量相关毒性、免疫原性弱、半衰期短且较为昂贵等使其使用受到了一定的限制。但这些问题正在逐步解决，比如将细胞因子基因和免疫蛋白基因连接在一起，以DNA分子或者共表达成整合蛋白，接种免疫动物便可有效提高动物机体的免疫应答。随着对细胞因子更深入的研究，相信作为一种新型分子佐剂，细胞因子会在疫病预防控制中发挥强大作用。

2.4天然免疫佐剂

研究发现，从天然植物中提取的有些成份具有佐剂活性，因为他们具有天然来源、毒性低、代谢容易且不易产生耐药性等优点，进而在近几年的佐剂研究中越来越受到重视。天然免疫佐剂有多糖、黄酮、皂甙、蜂胶等。

2.5其他新型免疫佐剂

2.5.1免疫刺激复合物 是一种由抗原物和一种皂树皮的提取物糖苷QuilA及胆固醇按1:1:1混合后自发形成的具有较高免疫活性的脂质小泡，其主要用于增强亚单位疫苗的免疫原性。ISCOM应用较为广泛，可用于多种细菌、病毒、寄生虫病的疫苗。ISCOM具有递呈疫苗抗原和免疫佐剂的双重作用，所以其可刺激机体产生强烈、持久的“全面”免疫应答反应。

2.5.2脂质体 是由人工制备的类脂质小球体，由一个或多个和细胞单位膜的类脂双分子层相似的结构包裹着水相介质组成。研究表明，其对很多物质有免疫增强作用。脂质体具有佐剂兼载体功能，其结构有利于将抗原物质递呈给抗原处理细胞或其他免疫活性细胞。若将脂质体和弗氏佐剂或氢氧化铝胶混合使用，效果会更佳。

2.5.3 MF59佐剂不仅可以刺激体液免疫，而且还可刺激细胞免疫。由MF59佐剂加抗原制成的疫苗有多种，如猿猴、人艾滋病病毒和疱疹病毒等。

三、展望

    理想的免疫佐剂应该具有一些特征：对于特定动物副反应小；作用稳定持久；生产成本低；产生适当的免疫应答，诱导机体细胞或者体液免疫强度达到保护作用；其不同给药途径可能产生的副作用已研究清楚。今后佐剂研究的方向应该是，（1）从天然免疫和获得性免疫两方面研究佐剂的细胞分子免疫水平的作用机理；（2）寻找能够提高机体细胞和体液免疫水平，细胞因子分泌及免疫记忆等高效低毒的“全面”免疫应答的新型佐剂。

滨州柱子

厉害啊，学习了

wsh071117

厉害啊，学习了

哈德门

谢谢分享，多多学习一下