求教透明质酸钠含量测定

mountain1

如题采用咔唑显色法测定透明质酸钠，结果偏高。结构组成主要是透明质酸钠、卡波姆、纯化水、甘油和丙二醇，检测过阴性，发现本底有很高的吸光度，这是哪个组分有干扰呢？还是我操作有什么问题

lalali

虽然不知道，但是蹲一下答案

机智鼠

针对您的问题，采用咔唑显色法测定透明质酸钠时结果偏高且本底吸光度较高的情况，可能的原因有多个方面。首先，我们需要考虑的是样品中各组分对测定方法的影响。


1.  **卡波姆**：这是一种高分子聚合物，可能会与咔唑显色剂发生非特异性结合，导致吸光度增加，从而影响测定结果。建议在测定前进行预处理，如使用适当的溶剂或方法去除卡波姆的干扰。

2.  **甘油和丙二醇**：这些是常用的保湿剂，它们本身可能不会直接与咔唑显色剂反应，但高浓度时可能会改变溶液的折射率或粘度，间接影响吸光度的测定。确保这些成分在测定条件下不会形成乳浊液或沉淀，以免影响光路。

3.  **纯化水**：作为溶剂，其质量对测定结果至关重要。确保使用的纯化水无杂质，特别是无有机物残留，因为这些杂质可能与咔唑显色剂反应，造成背景吸光度升高。

4.  **操作问题**：操作过程中的准确性也是关键因素。比如，试剂的添加顺序、混合均匀性、反应时间的精确控制等都可能影响最终的吸光度读数。建议严格按照标准操作程序（SOP）执行实验步骤，并考虑进行空白对照和回收率实验以验证方法的准确性。

5.  **法规或指南参考**：在进行此类分析时，应遵循相关药典或行业标准，如《中国药典》中的相应章节，以及国家药品监督管理局发布的关于药品质量控制的相关指南。

综上所述，建议您逐一排查上述可能的干扰因素，并优化实验条件和方法，以提高测定的准确性和可靠性。如果问题依旧存在，可能需要进一步的实验设计或寻求更专业的技术支持。

【鼠鼠还在学习中，内容仅供参考（药搭GMP软件提供技术支持）】

jidamaple

考虑液相吧，显色法干扰很多

Chowvine

丙二醇和甘油会在硫酸作用下变色。

mountain1

Chowvine 发表于 2025-2-10 08:45
丙二醇和甘油会在硫酸作用下变色。

在530.nm下也会显色吗？我看有产品也有甘油，还是用的显色法

Chowvine

mountain1 发表于 2025-2-10 09:27
在530.nm下也会显色吗？我看有产品也有甘油，还是用的显色法

看你加的含量 甘油变色比较浅，淡黄色 丙二醇可能会深一点 你可以把这两个原料单独用硫酸水解一下看看颜色变化。

Chowvine

mountain1 发表于 2025-2-10 09:27
在530.nm下也会显色吗？我看有产品也有甘油，还是用的显色法

有颜色就会影响吸光度，跟波长关系不大。。

鸠摩罗什

含量检测注意事项如下
Precautions for Assay test of sodium hyaluronate are as follows:
1）检测使用的试剂供应商选择非常关键，尤其是硫酸，试剂选择不当对结果影响巨大。
试剂不好，试剂反应后，试管中溶液颜色会有发绿、黄、棕色或颜色变浅等异常颜色，亦有可能目视
发现不了异常。
The selection of reagent suppliers used for testing is very critical, especially sulfuric acid, and improper
selection of reagents has a huge impact on the test results. If the reagent is unsuitable, after the reaction of
the reagent, the color of the solution in the test tube will be green, yellow, brown or the color of the solution
will become shallow, and other abnormal colors, and it is possible that no abnormality can be found visually. 正确的颜色：空白管无色、澄清透明；标准管及样品管澄清透明紫红色
Correct color: blank tube colorless, clear transparent; standard tube and sample tube clear transparent purple
red. 四硼酸钠硫酸溶液配制：难溶，需要提前几天配制，期间强力震摇数次。
Preparation of disodium tetraborate sulfuric acid solution: disodium tetraborate is hard to dissolve in sulfuric
acid and need to be prepared a few days in advance, and strong shaking several times during dissolve. 2）确保样品充分溶解
Ensure that the sample is completely dissolved
建议磁力搅拌、过夜溶解，转速为 800-1200 转。二次稀释磁力搅拌时间不低于 40min。
It is recommended to use magnetic stirring for overnight dissolution with the speed 800-1200 RPM. Secondary dilution with magnetic stirring is not less than 40min. 3）注意水浴为“沸水浴”，水处于沸腾状态，建议用电磁炉等能达到“沸水浴”的设备，不建议使用普通
水浴锅。
Note that the water bath is a "boiling water bath", the water is in a boiling status, it is recommended to use
induction cooker that can achieve "boiling water bath", it is not recommended to use ordinary water bath. 4）加入四硼酸钠硫酸溶液前，各试管提前放入冰水浴（冰水混合物）中冷却。一定要确认彻底冷却
再加入 0.1%咔唑溶液，注意加完咔唑一定要快速摇匀约 10-20 秒，完成后立即将试管放入沸水浴中。
Before adding disodium tetraborate sulfuric acid solution, each test tube is put into iced water bath (ice and
water mixture) in advance to completely cool. Be sure to thoroughly cooled before adding 0.1% carbazole
solution, note that after adding carbazole must be quickly shaken for about 10-20 seconds, immediately put
the test tubes into the boiling water bath.

鸠摩罗什

这种复配溶液，干扰比较大。
组分干扰
卡波姆：卡波姆是一种高分子聚合物，在酸性条件下可能会发生结构变化或降解，产生一些能够与咔唑试剂反应的物质，从而导致吸光度升高。
甘油和丙二醇：这两种多元醇类物质在强酸环境下可能会发生脱水反应，生成一些具有共轭双键结构的化合物，这些化合物可能会与咔唑试剂发生显色反应，干扰测定结果。
操作问题
试剂纯度和质量：如果所使用的浓硫酸纯度不够，含有较多的杂质，如铁离子等，可能会与咔唑试剂发生反应，导致本底吸光度升高。此外，咔唑试剂本身的纯度和质量也会影响显色反应的特异性和灵敏度。
显色条件控制：显色反应的条件，如硫酸的加入量、水解温度和时间、咔唑试剂的用量以及显色后的冷却方式等，都会影响显色反应的程度和稳定性。如果这些条件控制不当，可能会导致显色反应不完全或过度，从而引起结果偏高。
样品处理过程：在样品处理过程中，如果样品没有充分溶解或存在杂质，可能会影响显色反应的进行。此外，如果样品在处理过程中受到污染或发生降解，也会导致测定结果不准确。
建议
优化显色条件：对显色条件进行优化，如调整硫酸的加入量、水解温度和时间、咔唑试剂的用量等，以获得最佳的显色效果和稳定性。
提高试剂纯度：使用高纯度的浓硫酸和咔唑试剂，以减少杂质对显色反应的干扰。
改进样品处理方法：确保样品充分溶解，并在处理过程中避免污染和降解。可以考虑使用过滤或离心等方法去除样品中的杂质。
采用其他检测方法：如果咔唑显色法的干扰问题无法有效解决，可以考虑采用其他检测方法，如高效液相色谱法等，以提高测定的准确性和可靠性。

lelele--

学到了，感谢

cloudsky

组分干扰
卡波姆：卡波姆是一种高分子聚合物，具有一定的酸性基团等结构。它可能与咔唑显色试剂发生非特异性的相互作用，比如其分子中的某些基团可能会与显色反应中的试剂结合，从而影响反应体系的吸光度，导致本底吸光度升高，使透明质酸钠的测定结果偏高。
甘油和丙二醇：一般情况下，甘油和丙二醇化学性质相对稳定，在咔唑显色法的条件下，不太容易与试剂发生反应而产生明显的干扰。它们主要是作为保湿剂等存在于体系中，通常不会直接导致本底吸光度过高。
纯化水：纯化水如果符合质量标准，理论上不应含有能干扰咔唑显色法的物质。若纯化水受到污染，含有一些有机杂质或金属离子等，则可能对显色反应产生影响，但这种情况相对较少。
操作问题
试剂污染或变质
咔唑试剂：咔唑试剂如果保存不当，比如暴露在空气中时间过长，可能会被氧化或吸收空气中的二氧化碳等物质而发生变质，导致显色反应异常，使吸光度偏高。
其他试剂：用于配制标准溶液、稀释样品等的其他试剂，如硫酸等，如果纯度不够或被污染，也可能引入干扰物质，影响显色反应和吸光度测定。
样品处理不当
稀释不准确：在配制样品溶液时，如果稀释倍数不准确，导致样品浓度偏高，会使吸光度测定值偏高。例如，在移取样品或稀释剂时，使用的移液器不准确或操作不规范，导致实际稀释倍数与预期不符。
样品未充分混匀：透明质酸钠等样品在与其他组分混合后，如果没有充分混匀，可能会导致取样不均匀，使得所取样品中透明质酸钠的实际含量高于或低于平均含量，从而影响测定结果的准确性，导致吸光度异常。
仪器问题
比色皿不干净：比色皿如果没有清洗干净，内壁残留有上次测定的样品或其他杂质，会增加光的散射和吸收，导致本底吸光度升高。
仪器波长不准确：分光光度计的波长如果不准确，可能会使测定的吸光度值出现偏差。例如，实际测定波长与咔唑显色反应的最大吸收波长不一致，就可能导致吸光度测定结果偏高或偏低。
为确定具体原因，可以进行以下验证实验：分别单独测定各组分在咔唑显色条件下的吸光度，以判断是否是某个组分为干扰源；同时，仔细检查操作过程，重新准确配制试剂和样品，对仪器进行校准和检查比色皿的清洁度等，再进行测定，对比结果。