菌种传代大冒险：5次之内的黄金法则

沁人绿茶.

撰稿 | 石决明
来自 | 蒲公英Ouryao

《中国药典》2020年版9203药品微生物实验室质量管理指导原则中指出：“工作菌株的传代次数应严格控制，不得超过5代（从菌种保藏机构获得的标准菌株为第0代），以防止过度的传代增加菌种变异的风险。”
这个要求规定了菌种传代的起点和终点，目的是控制菌种在遗传过程中出现的过度变异，因为过度变异会使标准菌株丧失标准作用。

01
0代是金字招牌   

关于起点，《中国药典》2020年版通则1121抑菌效力检查法中表述稍有不同：“试验所用的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0代）”。干燥菌种其实就是冻干技术制作的标准菌株，按照ATCC的建议冻干菌种应储存在2至8°C，这样更便于运输和分发。  
而对于冷冻菌种（注意不是冻干菌种）的长期储存，ATCC建议使用液氮的气相或-80°C的冰箱。菌种保藏机构必须具有这样的硬件条件，而且要有完整的菌种追溯流程和菌种确认程序，才可以保证菌种在菌种保藏中心保藏期间的变异较小。
从这个意义上来说，并不是大大小小的保藏机构都具有这样的水平。能够提供一份详细的COA是最基础的要求，更好的方式应该是纳入供应商管理，甚至可以去现场审核。
所以，0代是人为划定的起点，只能是认可的保藏机构的菌种。可以说0代是一块金字招牌，代表对保藏机构品质的认可。  
而任何商业公司使用菌种保藏机构的标准菌株制作的培养物，无论名称是控制菌株、标准培养物、测试菌株还是质量控制菌株，都是派生菌种。其COA上必须注明由菌种保藏机构的标准菌株传代几次制作而得。
这就是指导原则9203中提到的“或使用与标准菌株所有相关特性等效的可以溯源的商业派生菌株。”


02
传代是什么？  

为了更清楚说明传代控制，指导原则9203中补充了传代的概念：“1代是指将活的培养物接种到微生物生长的新鲜培养基中培养，任何形式的转种均被认为是传代1次。”
在实际传代判断中，我们还会对“新鲜培养基”和“接种行为”的尺度区分存在困难。对于微生物来说，很多东西都可以算培养基，比如水、冻干菌种的复融液等等。  

上图中是微生物学历史上比较有名的彷徨试验，这个实验室为了说明自然突变的存在。但是如果从变异的角度去说：培养前分装到50个小培养管这个操作使变异率有所提高。换句话说，就是改变了培养状态就会提高变异情况。

我们可以得出结论：只有生长（或者说产生分裂），才会产生变异。那既然变异可能很容易就出现，那微生物转接到水中算不算一次传代呢？比如冻干菌种的重新水化或者复融。  

传代是菌种变异风险比较大的行为，什么程度的风险才算其实在历史上都讨论过。因此传代定义在USP<1117>微生物最佳实验室实践更新为：“一次传代被定义为将微生物从活性培养物转移到新鲜培养基中，并且微生物生长。任何形式的亚培养都被视为转种/传代。”

这就在新鲜培养基的判断标准之外又加上了培养结果的判断。别小看多这半句话，非常重要。 035代之乱

USP<71>无菌检查中要求：“not more than five passages removed from the originalmaster seed-lot”。相应的中国药典指导原则9203中表述，工作菌株的传代次数不得超过5代。“passage”是“传代”并不是“代”，中国药典中的表述让我们很容易混淆“传代”与“代”的概念，日常使用中经常就会听到“这是几代菌”这样的表述。而细菌的二分裂一次其实也就是十几分钟，5代也就1小时的事情。再加上很多文件中又推荐区分储存菌种和工作菌种。这样确定在标准菌株之外的传代次数时会存在一些困惑。  

根据《2023药品GMP指南：质量控制实验室与物料系统》中的菌种传代示例图，我们可以标记上“传代1次”的标签，这样我们就很容易统计一共经过了多少次的传代。  


至于为什么是传代5次的限制？这在ATCC的技术报告中有详细的描述，推荐大家去延伸阅读。
  

Lily_VIP

学习学习

younx

近日從廣東某微生物保存中心購得ATCC的0代菌株，要求其出具的證明，給出該“0代菌株”為廣東某企業提供，通過企業自己的操作製備了菌株，該中心檢測符合ATCC的0代的要求，即可以出售為0代ATCC菌株。

該0代ATCC菌株，是否可作爲真的0代ATCC菌株？

李沉思

目前公司所采购的ATCC菌种，仅进行了供应商的资料审查，提供溯源证明