【佚名原创】现实离15版药典有多远——无菌检查篇

仲夏秋夜云

小妖我是代发的，作者本人不愿意露面，原因你们懂的……

现实离15版药典有多远
之一·无菌检查篇

近日见了15版药典的意见征询稿，无菌项检查大改，抓紧整理与自家相关的东西。
1.改良马丁培养基改为胰酪大豆胨液体培养基（TSB）

10版：硫乙醇酸盐流体培养基主要用于细菌培养，改良马丁培养基适用于真菌培养。
15版：硫乙醇酸盐流体培养基主要用于厌氧菌培养，TSB适用于真菌和需气菌培养。

专家们终于知道培养需气菌是TSB比硫乙醇酸盐流体培养基管用了，就我感觉改良马丁培养基都比硫乙醇酸盐流体培养基管用，只是这么明改太坍台了，干脆扯个TSB出来——人家是国外进口的，欧典美典的要求吧。
不过根据经验，TSB养起真菌来未必有改良马丁培养基管用，毕竟含糖量少。白色念珠菌在TSB里就不如改良马丁培养基生长迅速（众专家怒：真菌又不是只有白念一种！）。
随着TSB“功能设定”的登场，再看看灵敏度检查与方法学验证（又称方法适用性试验）修改如何。二、三部药典无菌附录已合并。

灵敏度检查
10版：硫乙醇酸盐流体培养基（金黄色葡萄球菌/铜绿假单胞菌/枯草芽孢杆菌/生孢梭菌）30-35℃，改良马丁培养基（白色念珠菌/黑曲霉菌）23-28/20-25℃。
15版：硫乙醇酸盐流体培养基（金黄色葡萄球菌/铜绿假单胞菌/生孢梭菌）30-35℃，TSB（枯草芽孢杆菌/白色念珠菌/黑曲霉菌）20-25℃。
方法学验证：15版：以上，改铜绿假单胞菌为大肠埃希菌。

质疑ing~~
培养温度统一了二、三部药典，只是为啥跟随10版三部药典的脚步呢？我这边大部分无菌检查样品是二部的。
这硫乙醇酸盐流体培养基真心是“主要用于”厌氧菌培养基的吗？我怎么觉得“30-35℃”培养细菌是它的主要功能呢！
这TSB真心是“适用于”需气菌的吗？他们也就只敢丢个不挑剔温度的枯草过来做灵敏度，你要是丢个金葡铜绿过来，我看20℃它们长不长！

现下用于药品无菌的两培养基批批灵敏度检查了，枯草白念黑曲在TSB那儿又经历过多次无菌灌装验证用培养基的折腾，所以对于灵敏度检查来说，依然都是浮云。
但方法学验证就不是浮云了，所谓“方法学”，还得沿袭着看下去，这检验量或许也有更改呢。

话说三部药典的无菌方法学验证菌种是这样子进化的：
05版三部（≠任何二部）：乙型溶血性链球菌、短小芽孢杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌
10版三部（＝05版二部）：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉菌
15版三部（＝10/15版二部）：金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉菌
——我就说10版三部跟随05版二部，却不跟随10版二部，是个天大的笑话。

2.菌液扩增培养基的修改

营养肉汤（NB）改为TSB，用于扩增金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌。
改良马丁培养基改为沙氏葡萄糖液体培养基（SDB），用于扩增白色念珠菌。
改良马丁琼脂改为沙氏葡萄糖琼脂（SDA），用于生产黑曲霉菌的孢子。

这怎么看怎么别扭，TSB只需要检测枯白黑的灵敏度，却在这儿带着“我用于扩增细菌”的招牌，养起金铜大枯。混乱中。
可为什么抛弃NB了呢？难道不能不指定扩增培养基，或加个推荐性的“如”字？让检测人员自行选择不成么？——有些菌我是倾向于用NB扩增的，不含糖，菌液均匀稳定，稀释梯度易估算；那TSB会使某些菌（比如铜绿最明显）爆发生长。再说NB是不会被逐出微生物实验室的，菌种保藏得用NB，TSB的糖会坏事。
生孢梭菌忠贞不渝地选择硫乙醇酸盐流体培养基，只是计数方法，药典依然没有明示。
白念黑曲用沙氏葡萄糖系列我倒可以理解，这培养基增真菌的速度不亚于改良马丁培养基，看来后者是要被淘汰了。

3.稀释液冲洗液种类的增加

高兴地说，生理盐水终于被15版药典认可，能够光明正大被推荐作为稀释冲洗液了，这是借了三部药典合并的光环吧。

4.生物制品无菌检查依然两份的硫乙醇酸盐流体培养基

一般样品：1份硫乙醇酸盐流体培养基30-35℃+1份TSB20-25℃
生物制品：1份硫乙醇酸盐流体培养基30-35℃+1份硫乙醇酸盐流体培养基20-25℃+1份TSB20-25℃

555，还是不改啊，这可牵涉到方法学验证，那儿说“置规定温度培养3-5天”，这“规定温度”到底是指灵敏度检查中指定各菌生长的“规定温度”？还是无菌检查中指定各份滤器培养的“规定温度”？

话说真要是测试“样品+硫乙醇酸盐流体培养基”的金黄色葡萄球菌/铜绿假单胞菌/生孢梭菌20-25℃，长不了的吧。
另好事哪个厌氧微生物非要20-25℃的硫乙醇酸盐流体培养基才能长出来……

5.阳性对照的具体操作

15版：“……无抑菌作用的供试品，以金黄色葡萄球菌为对照菌；……供试品用量同供试品无菌检查时每份培养基接种的样品量。阳性对照管培养48-72小时应生长良好。”
就这么多，既不明说多出来的那一份阳性对照该是用（跟随金葡菌灵敏度的）硫乙醇酸盐流体培养基，也未明示阳性对照管该放置于（跟随金葡菌灵敏度的）30-35℃培养。更不说这阳性对照操作是无菌当日，还是允许14天后进行。——你们这算是药典的艺术么？

还有，生物制品若失去了“可14天后接种阳性对照”的特权，无菌当日，一次四个集菌培养器？有卖不？还是用两组两联体？
嗯，有一种最坏的理解：你这不是金葡么，你这不是两份跟随金葡的硫乙醇酸盐流体培养基么？你金葡的阳性对照做两组两个温度！！！——我保证第一个喊冤的不是我，“每份培养基接种的 样·品·量”绝对会让领导们心痛的~~

6.上市抽验样品的最少检验数量

表1《出厂产品最少检验数量》核对过了，未修改。上市抽验是表2，我们这儿适用于进厂物品的无菌抽样量计算。涉及到无菌包材和甘露醇。
500ml规格的液体制剂从6个改成了10个，开的甘露醇瓶数更多了。
“医疗器具”10版的表2是没有的，我一直按着《GB-T 14233.2-2005 医用输液、输血、注射器具检验方法 第2部分 生物学试验方法》的规定鬼混。这下15版明确了，医疗器具 供试品最少检验数量是10，若供试品每个容器内的装量不够接种两种培养基，那么表中的最少检验数量加倍。——就是说注射器/胶塞/助力器/无菌针/无菌袋这些结合表3“每支供试品接入每种培养基的最少量是 整·个·器·具”，一次无菌检验量是直接接种法的10+10+1=21了喽。

7.供试品的最少检验量

最天雷的表3来了，什么培养基种类，什么菌种归属，这个表一出，成本刷的就窜上去了。
就看与我们产品相关的几列。
供试品装量V≤1ml，全量。——这条没有争议。直接接种法41支，薄膜过滤法60支，生物制品这规格范围的我们没有。

10版（二部）
1＜V＜5，  半量
5≤V＜20， 2ml
20≤V＜50，5ml

10版（三部）
1＜V≤5，  半量
5＜V＜20，  2ml
20≤V＜50，10ml

15版
1＜V≤40，半量，但不得少于1ml

这是神坑啊，以10ml装量举例，20支最少检验数量已定，按着10版，这10ml最多可以供给5份培养基（每份培养基索取2ml），就算要使3份集菌器+2份阳性对照也够了；到了15版，10ml只够给两份培养基，非生物制品，抽30支，生物制品，抽40支。
哦，易溶的样品做时倒无所谓，40个，无非是时间长点罢了。若是大规格的凝胶呢？稀释液体积成倍翻上去，我给算算：
20ml凝胶，6mg/ml，需稀释到1mg/ml过滤，30瓶*20ml*6体积稀释液÷3集菌器=1200ml——一张膜不是只允许过滤1000ml的么？死路中。
要不继续直接接种法？翻去看，忽然觉察了15版这么改的阴谋！
直接接种同理要求半量，又有接种样品体积最多为培养基体积10%的规定，那么20ml规格，直接接种的每种培养基是：20瓶*10ml半量*10倍=2000ml，要配好多培养基呀，于是大家都会倾向于薄膜过滤了是不？那才100ml滤筒。
我服了你们成不？
我用酶去，哼！

窃以为这个规定不一定行得通，我这儿的产品只是黏稠难滤需要稀释而已，其他药品呢？那些抑菌作用强的，好不容易驯化了一个合适的中和剂，你这一规定，样品量加上去，中和剂也跟着加，这方法适用性试验可有的头疼了。
等最终版的定稿。

8.改版定稿后需做的事情
（1）把无菌灌装验证用TSB尽量与无菌检查用TSB归在一个批号，方便管理。
（2）现在开始如果要买改良马丁培养基，切记不可买多了。
（3）灵敏度检查重做。
（4）Z产品2ml、2.5ml、3ml，E成品5万（=10ml）、其他效价（如果有的话），E半成品，E稀释液10ml、其他体积（如果有的话），Y原料药，N产品眼科，以上这些，方法适用性试验重做。也别省略什么菌了，我可不想去个药检所提供的报告是补充版的补充版，全体过一遍。
至于N产品的外科，方法学肯定也同上一起做了。可到底是直接接种法还是薄膜过滤法呢？前者的接种量会让培养基泛滥，后者的接种量必定要用酶，等着15版定稿再说。纠结的大规格，万一哪日它大到100ml去了怎办……

2014.5.13
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之二·微生物限度检查篇
继续钻研15版药典意见征询稿的微生物限度检查部分，出厂产品们是没一个做微生物限度的，进厂原辅料包材们打擦边球参照着就行，工艺用水则是最大的原辅料，逃不了改版的命运。
1.营养琼脂（NA）改为胰酪大豆胨琼脂（TSA），玫瑰红钠琼脂改为沙氏葡萄糖琼脂（SDA）

传说TSA比NA灵敏很多，众多一部药典的中药会遭殃，反正殃及不到我们这儿，我可不信水中菌在TSA上会大大多于NA。再说环境监测平板早已从NA改成了TSA，这会儿抛弃NA，统一管理TSA，便捷了很多。
SDA替代玫瑰红钠琼脂，窃以为玫瑰红钠的“染色”计数虽然便捷，但这染料很伤菌，薄膜上的菌们都奄奄一息了，对比NA上的菌就活蹦乱跳。所以换成了SDA，对真菌的供养差不多，点计数难点就难点罢。培养温度小小修改了下，由10版的23-28℃改为20-25℃。若追求管理细节：玫瑰红钠是红色的，SDA与TSA颜色相近，有混淆的风险。
同理干粉的灵敏度检查都得重做。
TSA：需氧菌总数计数（金黄色葡萄球菌/大肠埃希菌/枯草芽孢杆菌/白色念珠菌/黑曲霉菌）30-35℃
SDA：霉菌和酵母菌总数计数（白色念珠菌/黑曲霉菌）20-25℃

首先小小质疑下，这TSA30-35℃的白念黑曲是不是写错了？能长不？还是说，若是某样品的微生物限度检查只要求“需氧菌计数”，便可以TSA通吃了？

关于培养基的灵敏度检查细节修改如下：
待测菌液的由10版的“50-100CFU”改为“小于100CFU”，想必是专家们不得不承认一块90mm平皿中黑曲霉菌的50-100CFU计数实在太难了，于是集体改掉。
计数方式的限制被改没了，10版强制平皿倾注法，现在涂布法也行了，薄膜过滤法不知道行不？呃，我就不自讨苦吃了，涂布最简单~~
灵敏度合格标准由10版的“不小于对照培养基70%”改为“在对照培养基50-200%的范围内”，切，万一那对照培养基的营养远差于被检培养基、结果超过200%怎办？比如某个玫瑰假单胞菌在某进口TSA上是某国产TSA的1000%以上……（众人怒：没见到只需要检 金/大/枯 么？ 它们不挑剔营养！）

2.关于微生物限度计数方法的适用性检查

也就是所谓的方法学验证。这套东西对于出厂产品是必须的，可这儿一个出厂产品的微生物限度检查都没，最被药典控制的也就是工艺用水的微生物限度检查了，“水”这个东西总不需要做适用性检查的。再接下来就是A产品正准备报批的新工艺中有个半成品的微生物限度检查，终究也不是成品。再往下看，排上号的当属制剂用A级原辅料，氯化钠、两个磷酸盐，产品中控性质的A/N缓冲液、E半成品过滤前、Y料液。最后才是纯进厂检验、纯企业内控的包材微生物限度。
左看右看，也没哪个样品强制适用性检查了。于是排队吧，先搞定无菌检查的那些适用性检查，再折腾你们。

这儿的细节方面就一条：只要求测试的菌液不大于100CFU。比10版50-100CFU要求低（貌似是沾光了MPN法的TSB，人家是液体，100CFU以下就行）。10版还有个坑人的规定说“（薄膜过滤法）最后一次的冲洗液中加入50-100CFU试验菌”，15版的样子是能把菌液直接混样品一起滤，省去冲洗液，多好。

3.计数报告方式

10版：细菌数=NA或玫红平皿中细菌菌落数高的结果，霉菌和酵母菌数=NA或玫红平皿中霉菌和酵母菌菌落数高的结果
15版：需氧菌总数=TSA的总菌落数（包括真菌菌落数），霉菌和酵母菌总数=SDA的总菌落数（包括细菌菌落数）

见鬼，似乎是要求翻倍严格了？
如果某样品，所含菌都是些易养的，同时做这四种平皿：
NA：细菌10，霉菌3
玫红：细菌8，霉菌5
TSA：细菌10，霉菌3
SDA：细菌8，霉菌5
按照10版，结果报15CFU；按照15版，结果报26CFU。
当然，15版也说了，你不满意SDA，你就用选择性培养基进行霉菌和酵母菌计数好了，比如那个含氯霉素的孟加拉红（传说是00版药典的？）也行的嘛！切，才不上当呢，不选用药典推荐的主流培养基，就是自找死路的说。
好在我们（主要样品）的工艺用水本身菌就不多，原辅料包材的日常水平也远低于内控标准。从严就从严吧，水处理的压力变大，关我啥事~
什么，还有JG、饮用水的微生物限度检查？那是食品标准看管着的，饮用水用NA，JG用计数琼脂。

4.改版定稿后需做的事情
（1）打探TSA与SDA标准培养基的采购情况。
（2）现在开始如果要买NA或玫瑰红钠培养基，切记不可买多了。
（3）灵敏度检查重做。
（4）找个含菌量较多的样品，比如饮用水（某饮用水偷笑：你以为我真的有菌么？），同步试验新旧四种平皿计数，看看结果是否真的翻倍了。
（5）进厂产品的微生物限度检查虽然不强制药典，但跟着药典走总没错的，比如参考取样量。

2014.5.16

沧海.

沙发围观。

了了.

不太懂，只是围观一下。为啥原作者不露面呢？蒲公英微信还想转载呢/

玻璃杯

改版后的微生物测试，会有越来越多不准确的结果？
可以这样理解？？？嘛？？

匿名

我的原创？

冰城

分开发更好些，这样一个版面太大了

eelannaoj

菌的特性全还给老师了，看的云里雾里，果断转给微生物实验室了

LK8275610

学习

幻影

神作。。怎么看起来有点像yuansoul。

道路漫长黑暗

了了. 发表于 2014-9-15 13:27
不太懂，只是围观一下。为啥原作者不露面呢？蒲公英微信还想转载呢/

感觉出这种深度技术文除了一线大厂就是政府单位的，学院系又不会这么快关注药典征求意见稿，猜测是体制内人员。

大呆子

学习了，云云可以开一堂课讲讲这个

野性之吻

这是谁  这是谁

阿旺

明白的又弄糊涂了

仲夏秋夜云

了了. 发表于 2014-9-15 13:27
不太懂，只是围观一下。为啥原作者不露面呢？蒲公英微信还想转载呢/

可以转，我问过了

无为

很恐怖，难道要委会遭到外星人围观沦陷了？

仲夏秋夜云

道路漫长黑暗 发表于 2014-9-15 14:08
感觉出这种深度技术文除了一线大厂就是政府单位的，学院系又不会这么快关注药典征求意见稿，猜测是体制内 ...

别想太多……我嘴巴很严实的。

yuansoul

幻影 发表于 2014-9-15 14:03
神作。。怎么看起来有点像yuansoul。

文风不对

幻影

yuansoul 发表于 2014-9-15 15:59
文风不对

匿名总还要收敛点吧。

杨曙光

学习了感谢有心人的整理和分享

静夜思雨

好久没接触微生物了，有点整蒙圈了。