大肠杆菌感受态细胞的制备及质粒转化

wangsheng0726

      

大肠杆菌感受态细胞的制备及质粒转化

      

【实验目的】

      

熟悉利用CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞的操作及质粒转化大肠杆菌的方法。

      

【实验原理】

      

当大肠杆菌生长到OD600约为0.2~0.4时，用冰冷的氯化钙低渗溶液处理大肠杆菌细胞，细胞膨胀成球形，可使大肠杆菌进入一种易于接受外源DNA的状态（感受态），处于此状态的细胞称为感受态细胞（competent cells）。此时，若在感受态细胞中加入质粒，则质粒DNA与Ca2+形成的复合物粘附于细胞表面，经过42℃短暂的热激处理后，DNA与Ca2+形成的复合物进入大肠杆菌细胞，在不含抗生素的培养基中短暂培养，使转入大肠杆菌质粒上的抗生素抗性基因表达，在含相应抗生素的选择培养基上可将转化菌（含质粒）与未转化细菌分开，转化细菌经过不断分裂增殖形成菌落，而未转化的细菌则不能。

      

【器材与试剂】

      

1．实验仪器  培养箱，恒温摇床，超净工作台，低温台式离心机，分光光度计，水浴锅，高压灭菌锅，微孔滤器（含0.22μm滤膜），酒精灯 标本检测

      

2．实验试剂  氯化钠（AR），无水氯化钙（AR），蛋白胨，酵母提取物，1.0 mol/L NaOH，氨苄青霉素钠，琼脂粉，LB液体培养基：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g， 800 mL蒸馏水溶解后，用NaOH溶液调pH至7.0，蒸馏水定容至1 000 mL，121℃高压灭菌20 min；

      

LB固体培养基：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g， 800 mL蒸馏水溶解后，用1.0 mol/L NaOH调pH至7.0，蒸馏水定容至1 000 mL，然后加入琼脂粉15 g，121℃高压灭菌20min，分别倒入无菌培养皿。若配制选择性培养基，当温度降至60℃左右时，加入1 mL氨苄青霉素溶液（100mg/mL），混匀，分别倒入无菌培养皿；CaCl2溶液：准确称取无水氯化钙11.1 g，用双蒸水溶解，并定容至1 000 mL，121℃高压灭菌20 min，4℃保存；氨苄青霉素钠溶液：准确称取氨苄青霉素钠0.5 g，用蒸馏水溶解并定容至5 mL，用微孔滤器过滤除菌后，分装于Eppendorf管中，-20℃保存。3.实验材料 E.coli DH5α, pUC18质粒

      

【实验步骤】

      

1．接种大肠杆菌单菌落于2 mL LB液体培养基中，37℃振荡（约250r/min）培养过夜。

      

2. 将2 mL过夜培养物转接到盛有100 mL的LB液体培养基的500 mL三角瓶中，37℃继续振荡培养至OD600约为0.2~0.4（约2 h）。

      

3．取1 mL培养物于一灭菌的Eppendorf 管中，冰浴放置10～30 min，4℃，1 500×g离心5 min，弃上清。

      

4．沉淀用0.2 mL冰冷氯化钙溶液轻轻悬浮，冰浴放置15 min，4℃，1 500×g离心5 min，弃上清。

      

5．沉淀再用0.2 mL氯化钙溶液轻轻悬浮，放置在冰浴中，制成大肠杆菌感受态细胞。

      

6. 取5 μL pUC18质粒(不超过10 ng)，加入制好的感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30 min。

      

7. 42 ℃热激90 s后，迅速置于冰浴5 min。

      

8. 加入800 μL培养基，37 ℃振荡（100 r/min）温育1 h，使pUC18上的氨苄青霉素抗性基因得以表达。

      

9. 取200 μL涂布于含氨苄青霉素钠 (100 μg/mL)的LB固体培养基上, 正向放入37℃培养箱中培养1 h，再倒置培养过夜至菌落清晰，统计菌落数量。

      

【注意事项】

      

1． 应使用处于对数生长期的大肠杆菌细胞，OD600最好不超过0.4。

      

2． 整个实验最好在低温环境下进行，以获得较高的转化效率。

      

3． 每次悬浮沉淀细胞要轻缓，避免剧烈振荡。

   

dasheng1980

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