细胞培养-成团成片统计交流

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临床检验样本库研究组，我们无外力培养优势是，正常顺利培养，冻复苏存传统方案要不能满足要求，可来信告知（准备走dmso方案，还是玻璃化干细胞方案），我们给出备份方案可验证，技术储备统计难养细胞时间较长，可能会有些优势，国外样本库自动化研究方向可深入讨论，试剂与技术可行性，我们是建系目的开发试剂已有七年技术储备，头几年还找不到方向，只是实战应用统计可行性，通过国外样本库研究资料统计，冗余试剂开发配套自动化很有优势。

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免疫细胞建系参考

1：建系目的，含血清方案（重复容易,成本低）结合简易单克隆法，克隆单细胞确保目的细胞，主单克隆群体增殖无影响（分出细胞在做鉴定）
2：避免外力（机械力，化学力）影响建系，国外样本库自动化研究已有案例介绍）
3：聚丙烯管进行进行细胞处理和分选，15%FBS+1640
4：可讨论最佳温度（4°C或15°C或室温）
5：低俗离心（国外临床样本库研究，没有拿到具体数据），国内经验谈，1000转（10分钟内）
6：冻存复苏：目前细工最优方案，DMSO8-10%+FBS40-90%,冻存前我司优化胰酶消化后成单个状态，比吹打成单个活率大大提升。新型冻存液有一年以上冻存复苏案例的，我们可配合免费推广。

离心机研发生产厂家，纳米磁珠分选免疫细胞研发生产厂家，路过可深入讨论，要能共享FAQ,我们可共享验证。
如流式告知型号，最佳培养基和细胞最佳浓度我们做些最佳方案推荐。
死细胞验证：低浓度碘化丙啶（PI），鉴别染料7-AAD告知厂家货号，我们统计下各厂家优略后，讨论试公布参考结果。
自动化培养需冗余试剂配合，我司建系目的，技术老师路过多多支持。

二倍体建系考虑马血请，猪血清方案的用户，高质量及稳定货源，我们试用建议做备份体系。痛点可提前讨论。预实验先行。

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20241105
类器官(消化），售后统计应用参考与讨论
无血清方案成团成片消化参考：用户悬浮培养无血清培养体系，消化备份方案参考（无动物源成份要求）
1：EDTA单独消化
2：培养过程中解离培养基
3：无酶消化液。
后面具体问题具体分析，就无酶消化后，细胞呈糨糊状分析，是无血清方案后培养特性，细胞缓冲能力弱，一是营养耗尽后，细胞马上呈现弱化现象，避免应考虑提前换液，无血清大部分厂家还是研发为主，替代血清还有待提高。无酶理论上对细胞损伤很小，结合无血清，要考虑细胞缓冲能力。

就以上问题，细工方案，先含血清大量培养后，在上无血清会好很多，充足细胞量是摸无血清条件不错的方案，细胞冻存复苏也涉及研发过程较重要环节，可就具体案例细胞讨论，种子库、工业应用，临床样本研究，对冻存复苏挑剔各类问题汇总统计中。

优化胰酶结合冻存复苏应用参考
冻存前细胞处理（特别是成团成片，易团聚类），细工胰酶对细胞膜无损，化学力消化后成单个状态，在执行冻存复苏程序降温，细胞活率大大提升，各类特点不一（免疫类团聚，神经胶质类团聚，腺类团聚）随各有各的特性，也有些总体规律性，例如上清回输，适合大部分团聚成团成片，要结合含血清无血清培养特点。

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自动化培养冗余试剂开发案例介绍-黑点、生长慢解决思路方法参考

问：
想请教一下各位老师，图里的是293t细胞，红框标识的地方细胞内有小黑点，而且会动，请问这可能是什么，有什么处理方案吗；当前尝试使用左氧当作支原体处理，目前看来无效？
就是怀疑细胞里面的黑点是某种胞内微生物污染
准备检测一下



答：
黑点讨论：用瓶用皿，生长时间多久，胰酶浓度可低些，提高血清浓度，换成瓶进口的，恢复下，养几天试试，要是生长时间长，上述很管用，血清厂家货号，培养基效期列出下，要是时间太长，补谷氨酰胺，或换成叫新批次，按上述做下，如有条件换成大牌子进口的，养几代会有改观。如有效果来信告知。我们统计黑点，生长慢问题

黑点发生，培养液不新鲜，血清营养含量不够，生长慢后，皿容易PH变化大，导致越来PH变化越大，过酸或过碱，瓶能改善，并能恢复，参考。我觉得检测意义不大，上述要列出来，问题就能很快排除，培养基都差不多，后面要长养细胞，叫新鲜要对厂家说出来，或者自己有补救办法。说的不对处请海涵。

验证后，再出现黑点问题，能很快排除，目前几个组按上述验证，用户还比较满意。

低浓度胰酶，0.05是个好习惯，消化时间虽然长些，膜无损更重要，正规库几个老技术都推荐，也不反驳同学用，0.25我们做自动化培养冗余试剂开发，胰酶浓度很关键。

0.25消化后的细胞，传代后会先恢复细胞膜在生长，细胞工厂大面积消化，我们有统计，还有就是成团成片类特性细胞，0.25容易把外面消化成泥，里面也没消化透 ，并伴随细胞老幼状态，上皮类团聚尤甚，293就是上皮类案例，老幼情况出现，细胞状态不一，难做后面实验，参考

避免建议，小克隆形成后，就用低浓度胰酶，消化成单个传代，大面积在消化，老幼问题用以出现，案例细胞，mdck

总结：类器官、人造肉、自动化培养、建系、微流控制培养等应用，长久看，各种培养中问题都要解决或者有突破，细工生物在这方面，根据自己能力财力，推荐含血清方案为主(容易实现，也是无血清培养条件验证大量细胞拿到验证前提，即便是临床研究应用目的，细胞量也是摸无血清培养条件前提)目前国内已有公司推出把类器官培养100培养工作一天完成成瘤成球，延展讨论以下体系培养中问题统计

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自动化培养（微流控制培养）配套冗余试剂包括
增强贴壁试剂说明书：自动化培养中促细胞贴壁，工业生产应用维持培养增加细胞产物等， 研发历程及工业案例
优化胰酶：对细胞膜无损，
解离培养基：贴壁细胞驯化成悬浮等应用
自动化转染试剂：毒性低，可通过自动化反复转染
自动化冻存复苏相关统计：临床样本研究高活率要求，配套自动化摸出精准SOP

以上案例验证最简单办法，找到痛点问题中类似可相通理论案例，多面验证确保方案可行性高，例如上面胰酶案例，我们是通过细胞工厂超大面积工业生产用户得到的实战数据，结果是提高用户产能效价，胰酶敏感细胞验证佐证，更多数据支撑，也是下面黑点，生长慢所有实验室都会面临的问题，找几个实验室一起拿到可行数据，对冗余理解要更全面（国外较大公司新品胰酶已经在EDTA加大含量，加快消化试剂，可种子库应用来讲，还要有更多数据支撑，化学含量增加对种子库影响面也要长期评测），膜损伤，机器对接等还要有更多部分考虑，无血清体系消化还有不同，该体系容易消化后成泥，就不能考虑膜受损部分，应该考虑无血清研发培养特点，要走其他思路解决-详细可告知问题详细讨论。可行方案验证。我们后面目的是建系，所以对试剂部份，都要有几年以上验证，才稳妥。冗余理念一点看法。

自动化培养设备（微流控制线片培养），需PDMS、PMMA连接细胞应用，我们可发增强贴壁试剂验证，2017年以来在相关应用介绍，链接是研发日记形式，就是技术开发人员列出案例及解决思路（验证结果等）

自动化培养中问题统计是我司一直统计的内容，好的问题就是产品开发成功一半心得，该设备比较贵，如您公司或者用户可共享使用该设备（告知地区及要求），我们相关用户群体很多（科研用户居多，也有些兽用疫苗用户），合作拓展更多人员上手实验，拿到更多痛点问题，也是未来潜在用户，从2015年开始PDX、类器官、人造肉、外泌体、细胞力学等相关研究统计用户。这些实验室上自动化难度大，经费，预判未来结果未知等，通过共享解决困惑等。

案例说明
黑胶虫污染统计
2011-12-02T00:00 (访问量:10523)-开始统计-如需要链接可发您
国内黑点，生长慢，成瘤不稳定可参考-结合自动化培养冗余试剂提出理由-细工方案终结方案可讨论，建系、耐药株参考有积极意义。
20230101-20241126-终结该类问题，涉及，培养基新鲜度，血清营养含量、耗材条件-具体可讨论-需列出厂家货号，邮件联系
相关统计关键词：难养各类系问题统计、 成团成片、简易单克隆、耐药株构建、冻存复苏、含血清救助、细胞工厂工业应用、进口大厂试剂特点，进口耗材统计。

十二年统计后细工方案参考，冗余试剂对自动化培养有积极意义，国内实验室多，培养条件复杂，人员多，问题也多，耐心找到问题中关键点痛点，在后面相关问题中得到实战验证，找到可行方案我们支撑，国内正规库四个库，各类难养细胞重点室，珍贵的痛点问题。大类分细胞系：乳腺癌类，肝癌、胰岛胰腺、免疫悬浮、神经胶质类，耐药株建立。纯国内技术、试剂完成细胞系建立是我们执着的方向，相关国外大厂家前言可行性我们有些建议可通过问题统计讨论。我们走含血清方案为主，无血清前沿也关注。如能兼职完成问题统计，我们可按您要求，共享或不共享统计内容。首家黑点，生长慢解决方案提供商。

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黑点，生长慢，成瘤不稳定组（冗余试剂验证与精准SOP汇总统计参考讨论）
冗余试剂开发需给设备、技术、细胞、水试剂、操作方法多方位融合，可行性高，基础实验要能顺利完成（解决痛点难点）或者提出可行性参考建系，国内五百家实验室，十年细胞培养问题统计，以最常见293案例，开始更多数据技术共享及自动化培养应用中统计开始，近五年细胞工厂应用，配合现在自动化培养、微流控制培养、细胞力学研究一些问题统计，统计更多自动化细胞培养中问题，建系目的，中式工业应用目的，简单易行思路。
以黑点，生长慢，提出细工方案参考，
需长期深入讨论，标注下，为讨论沟通精准性，建议告知详细资料需：
细胞来源，公司，正规库，等
耗材厂家货号
试剂厂家货号
细胞图片，增长描述，问题描述，实验理想目的。
珍贵株需救助的，对自动化培养有积极意义，讨论沟通标注下，我们最有兴趣的案例细胞，我们目的是建系，痛点难点问题更有兴趣，效果明显，成就感也大。
陆续后面会推出，简易单克隆可行性（国内建系为主），冻存复苏挑剔细胞（原代尤甚），自动化转染试剂开发、耐药株建立，缺氧培养是救助不成瘤主要思路（延展工业应用数据储备欢迎合作开发-工业户）相关资料都会发上来。