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口腔支原体（ATCC23714）和肺炎支原体（ATCC15531）的活化保种过程，通过学习比较和总结，其中的一些注意事项，以及 中国药典和欧美药典在支原体培养上的一些差异，感觉有必要和大家分享一下，互相学习探讨。活化保种过程大概总结如下：准备→购买→活化→保种。 一、支原体活化保种总结 1. 准备 这准备，是整个实验开展前的学习准备。因为0代的口腔支原体（ATCC23714）和肺炎支原体（ATCC15531）只有ATCC在卖，如果是第一次购买并尝试活化冻干支原体，那么把ATCC关于这两株菌的产品说明、检验报告模板、SDS、甚至包括ATCC细菌学指南《ATCC Bacteriology_Guide》等内容；包括2015《中国药典》三部3 301 支原体检查法、USP 《63支原体检查法》、EP《2.6.7. MYCOPLASMAS》等资料通读是十分有必要的。甚至还可以下载几本书来看看，了解下支原体的一些基本情况，例如《支原体学》第2版、《支原体-医学微生物学》、《支原体与支原体病》。在这一阶段最好能确定好活化冻干的具体流程，然后去按计划去实施。比如说：是要采用中国药典的支原体肉汤培养基和精氨酸支原体肉汤培养基，还是采用ATCC指定的ATCC 2611 培养基和ATCC 243培养基？以及是准备用甘油保藏法、还是直接分装法、还是冻干法进行保种呢？建议购买前先制定好计划，可以避免多次下单购买培养基或试剂。省时省力。 图1 支原体活化和保种相关资料 2. 购买
确定好了，就可以下单进行购买。我们这次冻干，采用了中国药典的配方培养基、也采用了ATCC指定的培养基进行活化。因为采用ATCC的配方培养基，后续如果出问题，ATCC才会承认。但是ATCC的配方培养基成分比较复杂，一些成分要从国外采购，耗时耗力，考虑到长期使用的方便性，故中国药典的培养基一并使用，两家进行比较，如果并无差别，后续就直接采购中国药典的培养基。建议初次活化的人，也建议两家的培养基都使用看看，如果确定中国药典的培养基好用，后面就可以直接使用中国药典的培养基。但是很不幸的是，在我们的这次比较当中，中国药典的相关培养基促支原体生长的能力比ATCC的配方培养基要差。 图2 ATCC口腔支原体和肺炎支原体 可以看出，ATCC的相关培养基成分是要更复杂的，所提供的营养可以说是更丰富的。“其中EP、USP的支原体章节对培养基配方中脑心浸液等以液体形式加入培养基的混合性生物原材料的主要成分含量做了明确的规定。《中国药典》支原体培养基配方中对以液体形式加入猪胃消化液和牛肉浸液，并未对两者的配方和制法有做进一步的规定。”（参见不同来源药品支原体检查用培养基的促生长能力研究_赵宏大）。这造成了不确定因素和国产培养基质量的参差不齐。从世界范围来讲，《中国药典》支原体培养基是属于“小众”产品。 注意：如果采用ATCC的相关培养基，其中像酪蛋白胰蛋白酶消化液、明胶胰脏消化液、马血清、10X CMRL 1066培养基、酵母提取物等这些配方有些是不对国内出售的，要和ATCC咨询替代产品，以及提早订购，免得耗时太久。 3. 活化 根据ATCC的产品说明书，大概步骤总结如下：
a. 按照随附说明打开小瓶。
b. 使用1ml移液器，移取0.5ml规定的肉汤培养基水化冻干粉。并混匀。
c.通过从原始管中转移0.25mL至含有2.5mL的管进行连续稀释。稀释是重要的，可保持支原体培养处于不同的生长阶段。一旦达到酸性或碱性条件，许多菌株将迅速消亡。
d. 液体培养基在密闭容器内培养，使用未接种的肉汤管作为阴性对照。
e. 可以接种平板以检查菌落形态。在37℃ 5％CO2中生长。固体培养基在微需养中培养，并保持充足湿度，防止琼脂表面干燥。
f. 口腔支原体接种到液体培养基里，在48到72小时内，在前几个稀释管中会出现中等到轻度的混浊。固体培养基上出现菌落需要更长培养时间。肺炎支原体菌株生长更缓慢，并且产生非常轻的浊度。可根据颜色变化来决定何时终止培养。从红色到橙色到黄色的指标变化很容易识别。当培养基为橙色时，支原体最好转移传代。变为黄色后，支原体已经开始死亡。 图3 肺炎支原体各个培养阶段颜色变化 左：培养前期呈红色 中：培养前中期呈橙色 右：培养后期呈黄色 图4 口腔支原体和肺炎支原体的菌落镜检图 图5 支原体煎蛋型菌落实物图 图6 支原体菌落结构图 “支原体由于缺少细胞壁，所以在固体培养基上会形成特殊的“油煎蛋”状，其中“蛋黄”部分是支原体向培养基内部生长的结果，“蛋清”部分是支原体在培养基表面生长形成的。在同一视野下区分支原体、细胞残渣、气泡对检定人员对支原体形态的辨识度要求较高，细胞残渣在固体培养基上没有均一的形态，边缘不整齐。而气泡在镜下观察则中心部分由于透光率高，镜下观察中心明亮，四周较暗。只有很好的区分出三者的区别才能在检测中减少误判、错判的概率。（参见易致污染的支原体在固体培养基上的形态特征 傅元欣）。培养时间、培养基成分对支原体在固体培养上的形态也有一定影响。一般支原体在固体培养基中培养2 ～ 3 天后才能在镜下观察到“油煎蛋”形态，且从第2 天起支原体向四周生长的速度明显加快，镜下菌体大小变化明显，7 天后菌体向四周生长的速度减慢但仍向培养基内部生长，菌体颜色逐渐加深、变暗，边缘由平滑变得粗糙不规整，菌体开始老化。” 4. 保种 保种方法有多种。据说液氮储存是最好的方法。不过条件受限。也可采用直接分装保存含支原体的培养基，在-20℃下保存，一般保存期限为1-3年；10%甘油保存法，在-80℃冷冻下，支原体可保存约4年；支原体冻干保存，在2-8℃下，可无期限保存。建议采用10%甘油保存法，有条件的采用冻干法。 10%甘油保存法：支原体生长后，将处于含对数期的支原体的培养基高速离心收集，肺炎支原体建议9000rpm离心30分钟，口腔支原体自己评估。倒去上清液，再悬浮于适量相应的新鲜肉汤培养基中。加入等量的20%甘油，甘油终浓度为10%。20%甘油可以高温灭菌，也可过滤除菌。
冻干法：支原体生长后，将处于含对数期的支原体的培养基高速离心收集，倒去上清液，再悬浮于适量相应的新鲜肉汤培养基中。加入等量的ATCC培养基9520（ATCC培养基9520为10％BSA和20％蔗糖的混合物，过滤除菌既得）中悬浮并彻底混合。取适量悬浮液分配到每个安瓿瓶中。放入冻干机内进行冻干。冻干程序可参考ATCC细菌学指南相关规定。 图7 支原体冻干粉 二、中国药典和欧美药典差异
通过对比可以看出，中国药典在支原体培养法中和欧美药典的差异、甚至可以说是不足，是十分值得思考和总结。比方说：CP所用培养基促支原体生长能力偏弱；CP没有规定支原体的培养条件中需氧量；CP没有限定支原体的传代次数；CP在支原体检查第一法中，并没有要求同步做阳性对照和阴性对照；CP仅凭肉汤颜色变化，便判断有无支原体并不够严谨，颜色的变化是有多种可能原因的，有可能是微生物污染，导致培养基pH变化，导致酚红指示剂颜色的变化。在判标上，欧美都要求将肉汤再次接种到平板上通过菌落判断。中国药典的这些差异，都给企业在支原体培养使用中增加不确定因素。所以，建议《中国药典》修订时将培养条件明确规定，液体培养基密闭管口，固体培养基应在5%左右二氧化碳的环境中培养；以及增加观察菌落来判标等内容。 参考资料： ATCC23714口腔支原体和ATCC15531肺炎支原体产品说明、检验报告 ATCC细菌学指南《ATCCBacteriology_Guide》 2015《中国药典》三部3301 支原体检查法 USP《63支原体检查法》、 EP《2.6.7. MYCOPLASMAS》 《支原体学》第2版 《支原体-医学微生物学》 《支原体与支原体病》 浅谈国内支原体培养和鉴定中存在的问题_赵旺胜 支原体检查试验培养条件考察_赵宏大 易致污染的支原体在固体培养基上的形态特征_傅元欣-
中国药典与欧美药典对支原体检查培养基规定的差异
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发表于 2018-9-11 14:42:26
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