RV沙门菌增菌液体培养基浅谈

Saureus

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作者：Saureus |  来源：蒲公英论坛

1. 培养基概述
RV沙门菌增菌液体培养基，英文全称是Rappaport Vassiliadis Salmonella Enrichment Broth，简称RVSEB，主要用于控制菌检查中沙门氏菌的选择性增菌培养。在TSB复苏培养后，取0.1ml加入10ml的RV沙门菌增菌液体培养基。

2. 培养基配方

美国药典RVSEB的配方如下

欧洲药典关于RVSEB的配方如下

Rappaport Vassiliadis Salmonella enrichment broth
Soya peptone	4.5 g
Magnesium chloride hexahydrate	29.0 g
Sodium chloride	8.0 g
Dipotassium phosphate	0.4 g
Potassium dihydrogen phosphate	0.6 g
Malachite green	0.036 g
Purified water	1000 mL
Dissolve, warming gently. Sterilise in an autoclave using a validated cycle, at a temperature not exceeding 115 °C. The pH is to be 5.2 ± 0.2 at 25 °C after heating and autoclaving.

中国药典已于2015版与欧洲药典保持一致即上述的中文翻译如下

以下是：MERCK（默克）关于RVSEB（货号1.07666.0500）的配方及说明

3. 培养基组分说明
除了微生物生长必须的碳源、氮源外，还有孔雀绿和六水合氯化镁。孔雀绿的主要用途是抑制杀灭真菌、大肠菌群；六水合氯化镁的用途是抑制变形杆菌和大肠杆菌的生长。
在这里，美国药典和欧洲药典并未说明不同培养基组分的混合顺序，但是中国药典明确了除了孔雀绿外，其他要先混合溶解，之后才加入孔雀绿，然后进行灭菌。
原因是：孔雀绿为有毒的致癌物，尽量减少与之接触。不过，除了培养基生产企业，现在的药厂都是购买成品干粉或颗粒培养基，按照供应商的说明书，直接称取相应的干粉或颗粒重量，加入纯化水即可。
另外，这里需要注意的是，与其他常用的培养基的灭菌条件121℃不同的是，该培养基灭菌温度为不超过115℃。
那为什么会不一样呢，原因在于六水合氯化镁。六水氯化镁又名水氯石、结晶氯化镁、卤片、卤粉，英文名magnesium chloride hexahydrate，分子量203。常温下为无色单斜晶体，呈柱状或针状或片状，有苦味，密度1.56g/cm3，易溶于水和乙醇，在湿度较大时，容易潮解。在空气中加热分解：
100℃时失去2分子结晶水；在110℃开始失去部分氯化氢而分解，强热转为氧氯化物；在熔点118℃时热熔分解，释放出HCl气体而变成氯氧化合物；高温下加热则分解为MgO和HCl。
由上可知，该培养基不能用常规的121℃进行灭菌，所以药典规定了115℃灭菌。

4. 灭菌程序开发

4.1 F值

F值用于衡量灭菌工艺的效力，描述了对于特定Z值的微生物在一个特定参比温度（T参比）下等效的杀灭率。用于计算杀灭率的数据来自于温度穿透探头的物理数据（F物理）或来自于生物指示剂杀灭数据（F生物）计算的SLR值。

4.2 F物理

F物理是致死率（L）对于时间的累计，表达为特定参比温度下对于一个特定Z值微生物的等效灭菌时间，以分钟为单位。F物理使用湿热灭菌工艺开发和验证研究中的产品穿透探头的温度数据计算得到。致死率计算的是某个时间点的杀灭率，通常以一分钟作为间隔。

L=10（T-T参比）/Z

F物理是即时杀灭率在给定时间间隔的累计总和。

F物理=∑L

当参比温度为121℃，Z值为10℃时，计算得到的杀灭率称为F0，果某灭菌工艺的F0值规定为15min，这个杀灭率水平等于在刚好121℃杀灭15min对于Z值为10℃的微生物杀灭率。
计算RVSEB灭菌条件的F0：

F0=∑10（T-T参比）/Z

即F0=15*10（115-121）/10=15*0.2511=3.76min
根据CPMP决策树：产品湿热灭菌在121℃进行15min，或F0≥8min，PNSU才能≤10-6。
根据PDA TR01：湿热灭菌工艺的物理杀灭率必须≥12min，才能保证PNSU≤10-6。
因此，从F物理角度来说，115℃、15min的并不是一个过度灭菌法。

4.3 F生物

F生物是实际测定的微生物杀灭率，可以由微生物的DT值和经过灭菌后测得的对数减少值（LRV）计算得到。因为生物指示剂孢子用于湿热灭菌F生物的确定，所以用属于孢子数减少值（SLR）代替对数减少值（LRV）。

SLR=lgN0-lgNF

其中，N0为暴露于杀灭力（F）前的初始孢子数量，NF为经过杀灭力（F）处理后的存活孢子数量。

F生物=DT×SLR

计算RVSEB灭菌条件的F生物：

（DT及初始孢子数参考MESA的一份COA）

F生物121=DT×SLR=0.4*（lg2.0*106-lg10-6）=4.92min

F生物115=DT×SLR=1.4*（lg2.0*106-lg10-6）=17.22min

根据据PDA TR01，湿热灭菌工艺的生物杀灭率必须≥12，才能保证PNSU≤10-6。因此，该程序并不是一个过度杀灭法。

但是，一般情况下，药品的微生物初始污染水平，每个单位产品不会超过102孢子，D不会超过0.3min，因此F生物121=0.3*（lg102-lg10-6）=2.4min。虽说该程序不是过度杀灭程序，但是也足够杀灭大多数的微生物，具有很大的安全系数。

5. 灭菌程序验证

基于上述内容，综合培养基成分的灭菌要求，建议该灭菌程序验证内容如下：

5.1 115℃ 15min空载热分布

可接受标准（参考PDA TM01及EN285/GB8599）：温度范围所有热电偶115-117℃；灭菌阶段同一时刻各热电偶之间差值≤2℃；温度控制探头与附近热电偶误差≤1.0℃。

5.2 115℃ 15min负载热分布（最小及最大装载）

可接受标准：同空载。

5.3 BI挑战（采用MESA SASU/6 BI）

布点同热分布，可接受标准，BI培养结果阴性，阳性对照阳性。

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xqliu

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syhorchid

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