技术 | 抗体生产过程中下游单元操作的内毒素控制措施

刘鹏飞

本期简单阐述一下抗体生产过程中下游单元操作的内毒素控制措施，原文链接在文末

内毒素（或称脂多糖）来源于细菌死亡后的包涵体释放物，属于热原的一种。注射含有热原的药液会导致热原反应，轻则使患者出现发冷、高热，重则昏迷休克甚至危及生命。一般注入人体的注射液中细菌内毒素含量达1μg/kg 时就可致热原反应。在生产过程中，生产用设备和系统及原材料(如辅料、培养基、添加剂、血清等)均可能受内毒素污染，因此在生产过程中需要执行严格的无菌操作及建立相关的质量控制策略,确保药品符合药典及临床使用的安全性相关要求。

通过下游纯化工艺的设计和调整，可以减少和清除过程中间产物中的内毒素，本文对于抗体下游纯化各个操作单元中去除内毒素的基本原理和考量做了概述。

亲和层析

在抗体的亲和捕获层析中，虽然内毒素不会吸附在层析柱上，但可以通过疏水和/或离子相互作用力结合目标蛋白或其他宿主细胞残留蛋白一起洗脱。内毒素对于单抗、双抗及融合蛋白有着不同程度的结合力，因此需要按产品和工艺要求通过层析淋洗的步骤增强内毒素的控制。研究发现，在洗脱前的淋洗添加1% Triton X-100、3mM EDTA 或者0.5M精氨酸能有效抑制内毒素和抗体的结合，减少量可达70%。

深层过滤

深层滤器结合不同的机理，如疏水结合、离子吸附以及分子大小筛选去除内毒素，而其效率取决于许多因素，如滤器材质 (如纤维素、活性炭、硅藻土等)、产品流体特性(如粘度、细胞碎片数量、温度等) 和流体颗粒特性(如硬度、颗粒大小、聚集性、胶体活性等)。由于通常情况下内毒素带负电荷（等电点在2左右），因此带有正电荷修饰的滤器对内毒素的去除效率较高，去除能力可达4 – 5个log。

阴离子交换层析

内毒素在常规抗体纯化工艺使用的工艺条件中带负电荷，因此能在阴离子层析操作中去除。一般来说，阴离子层析可以清除3-4个log的内毒素。通常可通过调节上样载量和柱上驻留时间、pH等提高内毒素去除效率。研究显示，使用比目标蛋白等电点略高的pH能增加蛋白表面的负电荷，有助于减弱内毒素与目标蛋白的非特异性结合，但也会导致流穿模式下目标蛋白和填料的弱结合，因此需在产品质量和收率之间的进行取舍和平衡。

疏水作用层析

由于内毒素的脂肪A部分有很强的疏水性，因此可以通过和目标蛋白的疏水性差异，使用疏水作用层析进行分离，其去除能力可以达到3-4个log。但内毒素分子会通过聚集而减少疏水结构的暴露，从而使得疏水层析对内毒素清除的效率有所降低，所以需配合添加螯合剂或吸潮剂减少内毒素的聚集体产生从而提高去除效率。

超滤洗滤

超滤主要靠分子大小分离内毒素。内毒素的单分子量约为10 - 30 kDa，但内毒素通常以聚集体形式存在，其分子量能超过100 kDa、直径达到约0.1μm。因此，可以使用 30 – 100 kDa孔径大小的膜去除内毒素。

小结

基于内毒素控制对药品安全的重要性，在生产工艺过程中，应持续监控不同单元操作的内毒素水平，同时，应积极通过工艺优化最大程度去除内毒素以及避免内毒素污染的发生。