用液相检测目标重组蛋白方法的疑问

冥河摆渡人 · 发表于 2023-4-26 09:51:32

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大家好，我司做重组蛋白，目标蛋白分子量在100-180KDa的，现在同一个液相方法重复性非常差。我想调整一下方法又没有太多方向，想请问做过的大神们，检测波长220纳米还需要调整吗？目前用的排阻柱，出峰时间是否仅仅和分子量大小有关，如果换用反相柱的话用哪种柱子？液相用的是安捷伦的超高效液相

henryizhao · 发表于 2023-4-26 10:08:39

用的什么流动相？

汉字太少 · 发表于 2023-4-26 10:21:15

你可以用二极管阵列检测器采集的图谱看一下不同波长的变化情况，再决定波长的问题，通常情况下波长不会变动。

逆流TCHEN · 发表于 2023-4-26 10:58:25

做下DAD波长扫描吧，蛋白质一般都用280nm，220nm有干扰。

冥河摆渡人 · 发表于 2023-4-26 12:16:16

逆流TCHEN 发表于 2023-4-26 10:58
做下DAD波长扫描吧，蛋白质一般都用280nm，220nm有干扰。

好的，正要准备试一下，谢谢建议

张寅 · 发表于 2023-4-27 13:12:27

理论上体积排阻的柱子就和分子量有关，但有时候蛋白会和柱子有一些非特异性的结合，可能会影响出峰时间或者峰宽什么的。我们之前有一个蛋白，需要提高流动性里氯化钠的浓度，否则峰宽很宽，峰型很丑。

反相我们用的是GL Sciences的C4柱子，因为有文献用的这款。可以市面上各个牌子的都试试看，做做demo样，Thermo的，waters的，飞诺美的，赛分的，等等

冥河摆渡人 · 发表于 2023-5-4 13:44:38

张寅发表于 2023-4-27 13:12
理论上体积排阻的柱子就和分子量有关，但有时候蛋白会和柱子有一些非特异性的结合，可能会影响出峰时间或者 ...

好的，多谢提醒。据有的朋友说柱子填料的疏水性和静电也会对蛋白有一定的吸附，现在想在这方面再做些尝试

[质量检验] 用液相检测目标重组蛋白方法的疑问

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