合理吗？原理和流程都懂，Co-IP还是没做出来！

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合理吗？原理和流程都懂，Co-IP还是没做出来！

      是生命活动的终极执行者。每个蛋白质都不是单打独斗的，而是与其它蛋白相互作用而发挥功能，从而参与到细胞增殖、分化、运动和代谢等方方面面的过程中。那么研究蛋白间的相互作用，扒清蛋白的“朋友圈”就尤为重要！下面小逸为大家列举了不同的研究蛋白间相互作用的方法。

今天我们重点来介绍一下Co-IP(免疫共沉淀，Co-inmunoprecipitation）。首先小逸与大家一起来理清IP与Co-IP这两个技术的用途：

一、掌握原理

Co-IP：是研究蛋白相互作用的传统“金标准”，是免疫沉淀技术的延伸，是利用特异性抗体捕获抗原，并进一步捕获与目标抗原相互作用的蛋白，然后再通过固相介质（如磁珠或琼脂糖珠）将目标抗原与其相互作用的蛋白富集下来。这其实与钓鱼很像，我们可以把固相介质想象为钓鱼者，抗体就是鱼竿鱼线，诱饵蛋白就是鱼饵，而猎物蛋白就是我们要钓的鱼。

二、实验流程

第一步：将抗体固定在固相介质上，如琼脂糖珠或磁珠，统称为beads；

第二步：将固定好的抗体与样品共孵育；

第三步：通过洗涤，去除未结合或非特异结合蛋白；

第四步：将互作蛋白从固相支持物上洗脱下来；

第五步：通过WB或质谱的方法，对互作蛋白检测。

三、对照设置

学习了原理和流程后，是不是想跃跃欲试开始做实验啦。千万别着急，实验设计要了然于胸；实验中对照设置是检验实验成败关键、文献发表的必要因素。小逸为大家整理了实验中需要设置哪些对照及如何通过对照的结果判断实验是否成功！

四、免疫共沉淀考虑因素

工欲善其事必先利其器，在正式开始实验前，我们要弄清哪些因素会影响免疫共沉淀，这样实验出问题了，我们才能追根溯源找到解决方法，达到事半功倍的效果。

一、样品制备——裂解液要选好

• 1． 使用非变性温和裂解液；
• 2． 避免使用离子型去垢剂如SDS，破坏蛋白-蛋白相互作用；
• 3． 可选择温和非离子型去垢剂（NP-40,TritonX-100）；
• 4． 裂解过程中，尽量避免剧烈超声和涡旋处理，以避免蛋白间相互作用。
  

二、抗体选择——要选经过IP验证的抗体

• 1. 抗体需识别诱饵蛋白天然构象，需选择经过IP验证的抗体；
• 2. 若研究的目的蛋白没有商品化抗体，可对目的蛋白进行基因改造，与标签蛋白融合表达，使用标签抗体进行实验。
  

三、固相支持物选择——磁珠or琼脂糖珠？



四、孵育顺序——要想得率高，顺序很关键

五、洗脱方式——下游实验不同，洗脱方法不同

ok，今天的分享就到这里啦，希望对大家有点帮助，下期再见~