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本帖最后由 朱小美 于 2016-9-5 11:19 编辑
作者：阿郎 丽珠集团 来自蒲公英小一班分享。
无菌制剂的模拟分装概述，当时报这个题目只是为了加强自我学习，还是学到哪写到哪。什么是培养基模拟灌装试验？就是使用培养基作为药品的替代品（Placebo）进行无菌模拟生产，对无菌工艺进行验证。无菌制剂，绝对是高风险中的高风险，无菌保障是第一位，而培养基模拟灌装试验则是保障无菌必须要做的，试验通不过，就不能做无菌产品，这是底限。哪些剂型哪些产品要做培养基模拟灌装试验？一是无菌原料（我没接触过，在此飘过），二是无菌制剂。菌制剂包括无菌分装的粉针剂（青霉素、头孢菌素、非青非头产品）、无菌冻干剂（指除菌过滤产品）、生物制品无菌制剂、非终端灭菌的中药注射剂等，均需要每半年进行一次培养基模拟灌装试验。
一、模拟灌装试验指南征求稿 最近网上流传SFDA查验中心2016年7月发布了《无菌制剂培养基模拟灌装试验指南》（征求意见稿），大致内容概述如下： 1、目的：充分评价药品生产企业的无菌操作水平。 2、适用范围：采用无菌生产工艺生产的无菌制剂。 3、定义：模拟无菌操作全过程，以评价无菌保证水平。 4、原则：模拟试验的前提是GMP合规； 首次或变更后需要对无菌生产过程风险点进行事先评估，评估结果在试验方案设计中予以考虑；关注开放操作、人工干预等高风险过程； 多产品多规格和显著差异的无菌工艺过程逐一开展模拟试验。 5、模拟范围：从第一步无菌操作开始，直至无菌产品完全密封结束。
6、方案设计及实施过程： 6.1前提条件是，厂房设施、文件、人员更衣及培训、密封性验证等均已完成； 6.2方案设计，应重点评估无菌操作的高风险过程，重点考察有人员参与的关健操作，证实无菌操作人员满足无菌生产要求。 6.3培养基：一般选广谱的胰酪胨大豆肉汤培养基（TSB），厌氧产品可用硫乙醇酸盐液体培养基（FTM），如为动物来源培养基，需提供无BSE（可传染性海绵脑病）/TSE（疯牛病）证明，也可先植物来源的培养基。 6.3.1培养基促生长能力试验，包括白色念珠菌（CMCC98001）、黑曲霉（CMCC98003）、枯草芽孢杆菌（CMCC63501）、金黄色葡萄球菌（CMCC26003）、铜绿假单胞菌（CMCC10104）、生孢梭菌（CMCC64941）六种标准菌株，还应考虑加入环境和无菌检查中发现的微生物，且接种量应控制在 10 CFU -100CFU/灌装单位，5 天的促生长试验，应证明培养基能够支持微生物的生长。 6.3.2培养基配制：应按照培养基生产商提供的配方配制培养基，并考虑降低非无菌培养基中细菌和霉菌生长的风险，以避免微生物生长导致培养基过滤性能降低。 6.3.3培养基的除菌与灭菌：除菌过滤，其可靠性是通过专门的除菌过滤挑战实验验证的，无法通过培养基模拟灌装试验的结果证实。 湿热灭菌，要避免过度灭菌，可采用湿热灭菌与除菌过滤联合使用的方式，但都应进行促生长性能检查。辐照灭菌，可避免支原体污染风险，常与除菌过滤联合使用。 6.4灌装量：灌装量通常应能达到容器体积的1/3～1/2，即可保证产品通过倒置和旋转接触到所有内表面并有足够的氧气支持微生物的生长，以利于对培养基的观察。企业应基于风险评估的原则对所设计的灌装数量、持续时间、模拟方式、预期收率作出合理说明。对大规模生产，即产品的生产批量大于10000 支，最低模拟灌装数量应不低于 10000 支，且不应低于产品实际生产批量的 10%。 6.5最差条件的选择（关键点）：应基于风险等级并结合无菌生产工艺、设备装备水平、人员数量和干预等因素来设计模拟试验最差条件。值得注意的是最差条件并不是指人为创造的超出允许范围的生产状况和环境，比如故意做AB级停电的无菌挑战是不能接受的。包括人员：应包括日常参与到无菌生产的全部人员，如生产操作、取样、环境监测和设备设施维护人员，同时应考虑以上人员交叉作业、班次轮换、更衣、夜班疲劳状态等因素。工艺时间 ：应适当考虑模拟实际生产操作过程中房间、设备、物料消毒或灭菌后放置的最长时间及最长的工艺保留时限等。灌装速度：采用最慢的灌装速度、最大的容器用以模拟最长暴露时间，也可采用最快的灌装速度、最小的容器用以模拟最大操作强度/难度。环境： 模拟试验挑战的最差环境应考虑选择单批产品无菌生产周期末端、间歇式生产的空调系统重新开启后或连续生产期间周期性灭菌最长的时间间隔。 6.6接下来是“干预”：干预可分为固有的干预和纠正性干预。固有干预是指常规和有计划的无菌操作，如装载胶塞，环境监控，设备安装等； 纠正性干预则是指对无菌生产过程的纠正或调整，如生产过程中清除破碎的瓶子，排除卡住的胶塞，更换部件、设备故障排除等。 6.7容器规格与容器闭封组合：一般选择应对最小和最大尺寸的容器进行培养基灌装模拟试验，通常采用透明的容器代替不透明或棕色的容器，以保证识别受污染模拟产品的能力。 6.8培养前的容器检查：模拟试验中完整性缺陷产品的剔除工艺应采用日常生产的剔除工艺， 除完整性缺陷的产品外，其他外观缺陷、灌装量异常的模拟产品也应进行培养并用于评估污染率。 6.9培养条件：培养前，应对模拟灌装产品进行颠倒、轻摇以使培养基接触所有内表面。培养时间至少 14 天，一般采用先在 20-25℃最少培养 7 天，然后在30-35℃的范围继续培养 7 天。 也可采用单一的 20-35℃的培养条件，但应有相关的数据证明培养条件有利于微生物的生长。 6.10培养后的检查：应对所有模拟灌装产品逐支进行无菌性检查，在培养期间定期观察培养基的培养情况，如在培养期间发现阳性样品，应做标记并立即移出培养箱（室）。 6.11计数与数额平衡：对各个阶段的模拟灌装产品进行准确计数：包括灌装、培养前检查、培养后检查的数量等。 6.12环境及监控：采样人员无菌操作能力及环境监测对无菌灌装的影响都应在培养基模拟灌装试验中充分评估。 6.13人员因素：所有被授权在生产时进入无菌灌装间的人员，包括观察人员和维修人员， 每年至少参加一次成功的培养基模拟灌装试验，方可参与正常生产的无菌操作，应保留人员参与相关模拟试验的记录。 6.14方案的实施：模拟试验的结果、评估和结论应形成书面报告并经质量管理部门批准，根据实施记录，为通过模拟验证的人员颁发确认书并规定有效期限。
7、可接受标准与结果判断：培养基模拟灌装试验可接受标准应当遵循现行 GMP无菌附录中的有关规定。应基于风险评估的原则制定科学合理的内控限度； 出现任何阳性均应进行彻底、规范的调查； 在科学评估的基础上采取适当的纠偏措施。如果连续进行的模拟灌装批中反复出现阳性意味着无菌生产工艺存在系统性问题，必须得到有效解决。
8、污染调查及纠正措施： 8.1 不管批量有多大，只要无菌工艺验证存在污染，意味着无菌保证可能存在问题，发现任何污染样品均应进行调查，应利用一切可能的方法调查污染的来源，污染调查流程及方法应在方案中明确规定。模拟灌装中出现任何数量的污染都必须视为偏差并彻底调查。分离到的污染微生物应鉴别到种属，鉴别结果应与本次试验过程所有微生物检测结果及企业微生物菌种库进行对比，为查找污染途径提供可能的依据。调查的关键是找到污染的来源，结合调查需要，必要时应制定完整的取样和微生物鉴别计划，调查过程应有记录并归档。 8.2 如调查找到指定的原因，应制定纠正预防措施，并再次进行模拟试验，以证明措施的有效性。如调查无指定原因，应对生产工艺过程的无菌控制开展系统性评估，同时应适当增加试验批次。 8.3 调查结果应形成书面报告并得到质量管理部门的批准。
9、试验周期及再验证： 9.1 新建无菌生产线，在正式投产之前，每班次应当连续进行 3次合格试验， 在无菌生产工艺中一条生产线存在多台相同功能设备时，应进行风险评估决定相关验证次数，但每台设备应至少进行一次模拟试验。 9.2正常生产期间应当按照生产工艺每条生产线每班次每半年进行一次，每次至少一批。对于设备因其它原因停产一定周期的生产线，在恢复正式生产前应考虑进行培养基模拟灌装试验 9.3空气净化系统 、生产用设备、无菌生产工艺及人员重大变更或设备的重大维修后，应当进行培养基模拟灌装试验。 9.4企业应充分评估生产线的风险，在发现设施、人员、环境或工艺的持续监测出现不良趋势或无菌不合格时，也应考虑再次进行模拟试验。
二、模拟灌装试验的实例 列举一个厂冻干针剂例子，方案介绍如下： 1、标题：XXX冻干粉针剂生产线培养基模拟灌装试验验证方案 2、签批：生产起草，由技术、检验、验证、QA等部门审核，最终QP批准。 3、修订历史记录：版本、修订日期、修订/更改要求的原因、修订人等。 4、目录：有20个项目，列有内容标题和页码。 5、正文 5.1目的： 根据GMP规范要求和厂验证主计划要求，特拟定本方案，对该生产线的无菌生产工艺进行再验证，通过此次验证确保该冻干剂生产线无菌保证水平。 本方案尽量使用与实际生产工艺相同的条件和操作方法，同时模拟最差灌装工况，向注射剂瓶内灌装经除菌过滤器过滤的胰酪胨大豆肉汤培养基（TSB medium），然后半压塞、模拟冻干、压塞、轧盖；将此制品在适当条件下培养检查其受微生物污染的程度，以确认无菌生产工艺过程的可靠性，并确认所采用的各种方法和规程防止微生物污染的水平能达到可接受的合格标准。
通过模拟灌装试验确认以下可能导致产品微生物污染的工况对产品无菌性的影响： | | | 灌装过程中直接与产品接触的器具及物料的使用前的储存时间 | | 在RABS层流保护下，胶塞、瓶子暴露4小时后的无菌性 | | | | | | | | 操作人员通过RABS手套对灌装、轧盖过程进行干扰的次数和时间（未打开门） | | 操作人员打开RABS门对灌装、轧盖过程进行干扰的次数和时间（打开门） | | | | | | | | | | | | |
5.2概述：其中工艺描述包括批量、产品包装形式、包装组件规格、生产线速度（模拟灌装的高、中、低速）、洗瓶、配料、灌装、冻干、轧盖的工艺过程描述；相对上次是否发生变更及风险评估。画出冻干粉针剂的生产线工艺流程图。
5.3参考文件：如SFDA的 药品生产质量管理规范--无菌附录（2010年）、 药品GMP指南--无菌药品（2010年）、药品生产验证指南（2003版）、EU的Guide to Good Manufacturing Practice for Medicinal Products（01版）、USA的Validation of Pharmaceutical Processes（3rd Edition,319-326）、PDA的Technical Report No.22  rocess Simulation Testing for Aseptically Filled Products（1996,50,S1）。
5.4缩写与定义：PQ、PV、QA、QP、CGMP等。
5.5职责：生产、技术、质量控制、质量保证等在本培养基模拟灌装试验中的分工和职责。如质量管理负责人职责为最终批准验证过程中的偏差或变更；最终批准所有验证方案； 最终批准所有验证总结报告。
5.6实施和文件要求：按《验证实施和记录标准操作程序》实施本项验证，收集和记录相关信息和验证结果。实施过程中如出现偏差或变更，或出现需要对方案进行修订的情况，填写“偏差表格”或“验证方案修订申请表”，并在“验证方案修订记录表”中记录本项验证实施过程中发生的所有方案修订。
5.7培训确认/签名表：记录所有实施本方案相关工作的人员，确认所有人员在方案实施前均已接受适宜的培训。所有实施本方案的人员，均须针对本方案和相应方法及相关SOP进行培训，以正确实施和记录相关工作。在实施方案前，在下表中登记姓名、部门名称，并签名和签署日期。
5.8验证前确认：一是文件：模拟灌装涉及的操作均有规程指导，包括名称，编号，版本号，生效日期等，确认实施前已生效。二是物料：如胰酪胨大豆肉汤培养基、瓶子、胶塞、铝盖、过滤器，六种标准菌株白色念珠菌、黑曲霉、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌。三是设备和设施系统验证情况确认：如空气净化系统、气、汽系统、灭菌和除菌系统验证、主要生产设备验证。
5.9培养基性能试验 5.9.1培养基无菌性能试验：取模拟灌装过程中经第二道除菌过滤器过滤后初期的培养基溶液100g和灌装结束后分液器及针头残留溶液用洁净容器收集100g，送至洁净室的超净台，将培养基以5ml/支的装量装入各20支已灭菌的试管中，各用作培养基无菌性能试验样品。（注意过滤初期的培养基不得废弃）。培养管先在20-25℃条件下培养7天，再在30-35℃条件下培养7天，观察菌落生长情况。培养14天后无微生物生长才算通过。 5.9.2培养基微生物生长性能试验：取模拟灌装过程中经第二道除菌过滤器过滤后初期的培养基溶液100g，送至洁净室的超净台，将培养基以5ml/支的装量装入20支已灭菌的试管中，用作培养基生长性能试验样品。取10支每管装量为5ml胰酪胨大豆肉汤培养基样品，分别接种菌液浓度为100-1000CFU/ml的菌悬液0.1ml的铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌各3支，另取1支不接种作为空白对照，30-35℃培养3天；取7支每管装量为5ml胰酪胨大豆肉汤培养基样品，分别接种菌液浓度为100-1000CFU/ml的菌悬液0.1ml的白色念珠菌、黑曲霉菌液各3支，另取1支不接种作为空白对照，20-25℃培养5天。判断标准是空白对照管应无菌生长，加菌的培养基管内菌落均生长良好且菌落形态与所加菌种相符，则该培养基可使用，否则换用其他培养基。
5.10模拟灌装安排 一是生产安排，确定灌装批量，灌装时使用多少ml注射剂瓶及相应胶塞，每瓶样品灌装多少量的培养基溶液，灌装培养基样品分别装载在冻干机的哪些板层，培养基灌装的持续时间至少达到多少小时。灌装机按规定速度进行培养基灌装。模拟整条生产线正常生产过程中的所有活动。 二是关键功能操作间同时容纳最多人数的确定，如轧盖间、清洗间、灭菌间、称量间、工衣清洗干燥间、洗烘瓶、消毒剂配制、灌装、冻干前室、配料间等各安排多少人。 三是最差工况的确定，我列几个主要的如下： 1、灌装间的人员在灌装期间至少2小时内达到房间额定的最大人数（如9人），其他时间（吃饭时间除外）不少于4个人（实际灌装操作需4人）。 2、灭菌后注射剂瓶、胶塞敞口暴露或暴露在RABS内的时间达到或超过工艺规定最大时间。 3、配制开始至第一道过滤结束持续时间，模拟工艺规定最长间隔时间。 4、模拟灌装用胶塞、铝盖尽量灭菌后存储大于72小时后再用于灌装。 5、灌装机和进出料系统需打开RABS门的干扰事件。如需打开RABS门处理的倒瓶、炸瓶（需开门和不开门处理的炸瓶事件均包括在内）、需打开门处理的胶塞堵塞，需打开门处理的灌装机装量调整、培养碟放置更换、需打开门处理的灌装针头排汽泡、需要打开门抽查装量及可见异物。 6、模拟使用无菌风险最差的板层进行装载产品进行模拟冻干。 7、轧盖机和进出料系统需要打开RABS门处理的干扰事件。如需打开RABS门处理的铝盖震荡斗卡堵、轧盖工位卡瓶、反瓶、卡盖、炸瓶、停机。 8、灌装机出现故障，维修人员进入灌装间维修。如模拟灌装机运行不正常，打开操作屏处电控柜柜门，检查线路、元件后，关上电控柜柜门，每次维修时间约30-60分钟。 9、每批灌装持续时间不少于实际操作多少个小时。 10、冻干机灭菌后最长使用周期。工艺允许在相同产品连续生产过程中，冻干机灭菌后的最长使用周期为第N天开始使用，间隔时间为N-1天。
5.11模拟程序 一是人员、环境、物料监控。按照日常监测方法对各区域的人员、空气系统进行监测，并将监测数据相关文件作为附件附在激素冻干粉针生产线模拟无菌灌装试验验证报告中。特别是模拟灌装过程对进入B级区的所有操作人员均需进行监控，主要操作人员每次进入B级区的人员离开退出时，头、口罩、胸部、肩部、手指、手肘、膝盖对其取样进行表面微生物监控。
二是注射剂瓶、胶塞和铝盖处理。记录试验用胶塞及铝盖灭菌结束时间，试验用胶塞及铝盖的领用时间，并计算二者间隔，试验需要胶塞及铝盖灭菌后储存至少72小时方可用于模拟灌装使用。
三是注射剂瓶、胶塞无菌检查。模拟灌装试验过程中，取部分已灭菌胶塞、已除热原注射剂瓶敞口暴露于A级区域，记录放置起始时间、放置结束时间，计算时间间隔，同时分别将部分模拟灌装结束后的物料进行无菌检查，其余物料用于正常模拟灌装并区别，检查结果记录于“灭菌后胶塞、除热原后剂瓶敞口放置时间检查表”中。
四是灌装器具灭菌处理。模拟灌装试验过程中，记录灌装用具灭菌结束时间，开始使用时间； 记录并计算相应的时间间隔，由于过程模拟时间较长，且前期均做过相关确认，故模拟灌装过程中每年至少模拟一次。
五是冻干机灭菌处理。模拟灌装试验过程中，记录冻干机灭菌日期至模拟灌装生产时使用日期；并计算相应的时间间隔，由于过程模拟时间较长，且前期均做过相关确认，故模拟灌装过程中每年至少模拟一次。
六是培养基的配制及处理。 l 按每批如2万瓶以上瓶产品的模拟灌装量，计算配制量。 l 通过无菌氮气压滤将培养基溶液经第一道除菌过滤器过滤至无菌存储罐。培养基溶液第一道过滤结束至第二道过滤开始间隔时间在N小时以内。 l 通过无菌氮气压滤，将培养基从无菌储存罐经第二道过滤器过滤后送至灌装机上的缓冲罐，进行灌装操作，当灌装瓶数可以分别装满两个冻干箱各一个板层即约N瓶时，停止对无菌储存罐和缓冲罐内剩余培养基溶液的灌装。这一阶段中所有正常生产过程中的操作，如取样、过滤器完整性试验等也按实际生产进行模拟。 l 在灌装开始前取经第二道除菌过滤器过滤后灌装开始前的培养基溶液约100g，用于培养基无菌性能试验，并计算物料平衡。 l 药液从配制开始到第一道过滤结束间隔时间验证：按照《配料系统操作规程》使用配料系统配制胰酪胨大豆肉汤培养基溶液。称量Ng胰酪胨大豆肉汤培养基在NL的桶中初步溶解后，再倒入混合罐中加水定容至Nkg搅拌混合均匀，模拟中间体检验结果等待，从配制开始即培养基开始溶解至第一道过滤结束应不少于4小时。模拟回收配料第二道跨接管剩余培养基，经两道过滤后进行灌装，回收后灌装产品与其他产品一起培养。 l 将培养基溶液配制及药液模拟回收时间记入“配制开始到第一道过滤结束间隔时间验证记录表”中。
七是无菌灌装 l 培养基模拟灌装批生产的灌装间人员：在生产结束人员将退出B级区时做微生物接触碟取样，通过表面微生物监测结果和培养基模拟试验的最终结果，确认可进行无菌生产的操作人员资质，没有按照要求参加培养基灌装的人员不能直接参与实际生产。 l 灌装班人员交接班工况：模拟灌装试验过程中，模拟灌装班人员换班操作2次，记录每次换班时间及人员，每批两次，其中进、出≥2次。检查结果记录于“灌装班人员交接班记录表”中。 l 模拟灌装过程安排：按灌装操作程序，将胶塞加入料斗内，注射剂瓶进入灌装机，过滤后培养基溶液送至灌装机上缓冲罐后，启动灌装机进行灌装进箱、模拟冻干、轧盖；轧盖后样品输送至目检工序进行目检。培养基第二道过滤开始至进料结束持续时间不小于N小时（包括交接班换班吃饭时间，模拟维修时间，空转时间）。灌装过程所有的正常操作如称重、检查、取样等都应模拟进行，灌装过程模拟检查可见异物和装量差异的样品，样品需无菌压塞后再模拟检查，检查结束后的样品，若无破裂和损坏，则均应随模拟灌装产品一起进行培养，同时做好标记。 l 打开/不打开RABS干扰事件工况：模拟灌装试验过程中，根据日常生产实际所发生的情况及次数，模拟灌装、轧盖RABS开门/不开门发生的干扰事件，并实时记录干扰事件发生时间及类型，检查结果记录于“打开/不打开RABS干扰事件统计表”中，干扰事件分别记录于“灌装过程打开RABS门干扰事件A记录表”“灌装过程不开RABS门干扰事件B记录表”“出箱轧盖过程开RABS门干扰事件C记录表”“出箱轧盖过程不开RABS门干扰事件D记录表”。 l 灌装机故障维修工况：模拟灌装试验过程中，模拟灌装故障维修，如每批模拟灌装模拟两次维修，第一次模拟灌装机瓶子在出料星轮处堵塞，出料星轮离合器过载，移除堵塞的瓶子，重新将星轮安装调整至合适的位置，维修时间约40分钟；第二次模拟灌装机运行不正常，打开灌装机机台下维修柜门，检查线路、部件后，关上维修柜门，维修时间约30分钟。 l 灌装时间确认：工艺规程规定每批产品灌装从第二道除菌过滤开始至灌装结束时间应≤N小时。在模拟灌装试验过程中，记录模拟灌装从第二道除菌过滤开始至灌装结束时间，检查结果记录于“灌装时间记录表”中。 l 冻干操作：按照以下程序模拟样品在冻干箱内的状态：灌装制品N ℃进箱，冷冻制品→放置样品的隔板温度均降至约N℃→冷阱温度降至-N℃以下→冻干箱抽真空约Nmbar→打开放气阀放气→加热隔板→隔板温度升至N℃→冻干箱抽真空约Nmbar→全压塞→打开放气阀放气→样品出箱。 l 出箱、轧盖：出箱后冻干箱的样品需收集，每个收集样品的中转盘上需标明收集序号。收集轧盖后的样品，目检后培养时将样品一半正立放置、一半倒立放置。记录记录出箱、轧盖开始到出箱、轧盖结束时间，确认出箱、轧盖持续时间不少于12小时。
5.12模拟灌装样品检查 一是灌装制品培养前检查： l 灌装制品经轧盖后，包装班人员在轧盖出瓶轨道末端按顺序接受样品，并装入中转盘中，每个中转盘上标记样品接收序号。由包装目检人员目检瓶身破损及铝盖、胶塞密封等缺陷情况，若有缺陷品，则剔除缺陷品并记录缺陷数量及缺陷原因。目检挑出的空瓶、破瓶、无塞中间产品作销毁处理；目检挑出的松盖、皱盖、浅盖、色点、装量差异不合格中间产品在铝盖顶部标记并登记，按原顺序放置于中转筐或盘中与正常产品同样条件下培养，培养结束后检查；若目检发现浑浊样品，则记录样品的盘号及其在盘中的顺序号，与正常产品同样条件下培养，培养周期结束后，送微生物室鉴别。 l 目检时上下颠倒振摇，保证培养基溶液与整个玻璃瓶和胶塞的内表面充分接触后，将灌装制品按不同批号区分，按顺序装入不锈钢盘或中转筐。 二是灌装制品的培养及检查： l 培养：将灌装制品按不同批号区分，同一批号不同板层的灌装制品也需分开放置（小批号样品一半正立放置、一半倒立放置），装入中转筐中，先置20-25℃培养7天，进行目检，将正立转成倒立，将倒立转成正立，将再置30-35℃培养7天；记录培养的起止时间，且灌装制品培养期间每两个小时至少记录一次培养温度至制品结束培养。在房间培养培养基样品，房间四个角和中央处均放置一个温度计，到达记录时间点后记录同一个房间内每个温度计显示的温度。将样品的培养观察结果记录试验批样品培养观察记录”中。 l 检查：样品在20～25℃下培养的7天、30～35℃培养的7天后，至少在第7天，第14天，由经过QC微生物检验资质人员的培训的目检人员（同时应当有QC现场指导）对培养后的制品的微生物生长情况进行检查，并由QA人员对检验结果进行复核，若发现有被微生物污染的制品，应记录瓶数、中间产品批号，并对菌种进行鉴别。 l 阳性对照：在模拟灌装的样品培养14天结束后，每批随机抽取培养基样品N瓶（抽取的样品需兼顾到每个板层的样品），压紧胶塞，送样至检验室。检验室人员对样品随机分成五组，每组12瓶，每组分别接种铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉、生孢梭菌，接种量均为每瓶0.1ml浓度为100~1000cfu/ml的菌，然后进行培养。接种铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌的样品在30-35℃培养3天，接种白色念珠菌、黑曲霉、生孢梭菌的产品在20-25℃培养5天。
5.13模拟灌装物料平衡 l 灌装后培养基样品丢弃记录：整个培养基灌装过程中需要严格控制丢弃任何已经灌装的培养基,任何丢弃都要有充分的理由,并做好相应的记录和解释，只要符合最低灌装量，就不应该丢弃。但如果是胶塞上位不正确的培养基，由于密闭系统不完整，必须进行丢弃。将灌装、轧盖、目检、培养过程中分灌装后培养基的丢弃记录记入“灌装后培养基样品丢弃记录表中。 [size=10.5000pt]l 物料平衡计算：配灌工序中间产品物料平衡；自动进出料、冻干、轧盖工序中间产品物料平衡；目检工序中间产品物料平衡。
5.14验证标准及结果评定 一是验证标准。培养基模拟灌装应以不长菌为目标，并遵循以下规则： l 当灌装数少于5000单位时，不得检出污染； l 当灌装数在5000-10000单位之间： · 出现一个污染单位，应进行调查，包括考虑重新进行培养基灌装； · 出现两个污染单位，应在调查后进行再验证。 l 当灌装数在10000单位以上： § 出现一个污染单位应进行调查； § 出现两个污染单位，应在调查后进行再验证。 二是结果评定：结果均应达到不长菌的目标，任何一次超过规定，且长菌的样品不是因为容器的破损造成的，则验证无效，应查明污染产生的原因，方可判断此灌装工艺过程符合无菌灌装要求。
5.15验证周期 l 培养基模拟灌装试验每半年进行一次； l 生产工艺变更、重要技术参数改变时、班次数有重要的变更后或关键设备更换、大修、变更安装位置等，须根据评估结果重新进行再验证。
5.16验证计划实施情况确认 | | | | | | |
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5.17工艺验证合格标准总结 审核该已实施的培养基模拟灌装试验，并确认所有的标准均已达到。如果方案有任何未完成项目，请说明。
5.18方案修改 按验证实施和记录标准操作程序，在验证实施过程中如出现需要对方案进行修订的情况，填写“验证方案修订申请表”，并在“验证方案修订记录表”中记录本项验证实施过程中所作的每一项方案修订。
5.19方案偏差 按验证实施和记录标准操作程序，在验证实施过程中如出现偏差或变更，填写“偏差表格”对偏差进行调查和处理。
5.20附录 将所有验证方案适用的数据和资料附在附件内。当添加资料/数据到附录部分时，请按表填写，并注明附录中的页数，若添加页没有编页码的，手动添加。
三、模拟灌装试验的问题讨论（共八个问题）
1、2015版中国药典需氧菌和真菌无菌检查改为胰酪胨大豆肉汤培养基（TSB），模拟灌装试验的培养基要改吗？ 答：不需要改。一般选广谱的胰酪胨大豆肉汤培养基（TSB），真菌、细菌都能长。如果以往产品有过厌氧成长，可以用硫乙醇酸盐液体培养基（FTM）模拟，同样条件去做模拟灌装试验，厌氧培养基一般会分层，上层用于隔绝下层的空气层导致厌氧菌在上层不长。厌氧菌要长也是在下层，但因有些瓶子不大，如2ml或5ml瓶子无法造出隔绝空气层，因模拟阳性菌瓶也是不长的，所以，既使有厌氧菌也难以存活，故大多企业是没有做厌氧培养基的模拟灌装试验。
2、指南征求稿中关于培养时间至少 14 天，一般采用先在 20-25℃最少培养 7 天，然后在30-35℃的范围继续培养 7 天。 也可采用单一的 20-35℃的培养条件，但应有相关的数据证明培养条件有利于微生物的生长。一是能否先30-35℃后20-25℃培养？二是采用单一的 20-35℃培养怎么操作？ 答：第一个问题：就是先低温真菌培养、再高温细菌培养，因担心有些低温菌先高温30-35℃培养会被杀死。另外，真菌相对细菌生长得慢，所以先培养真菌7天，后面还有7天的时间可继续长。而细菌生长得快，一般3天就能看出大致，所以可以后培养。 第二个问题：培养基灌装的培养温度，可以在做完培养基的促成长试验后，选择一个20-35℃的温度进行培养，但培养箱的温度要控制在正负2.5℃。
3、什么是培养基模拟灌装试验的“最差条件”？（转摘自医药微学堂，文章由四川蜀阳周珍字提供） 答：2010版药品GMP指南：在培养基灌装设计中，工艺条件的选择应选取合理的“最差条件”，用最差条件来对工艺流程、设备和整个体系进行挑战。如果在最差条件下能获得好结果，说明在比最差情况要好的实际生产中，无菌保证的可靠性更有保证。“最差条件”考虑如下三个方面： 一是设施、设备、包材和辅料清洁、灭菌后存放时间： 二是灌装人员及参数设定： 三是干扰项目的设计： 模拟实际生产过程中出现的各种类型的常规性干扰和非常规性干扰。在每半年的培养基灌装前应对上一阶段的生产状况进行总结和趋势分析，综合考虑有代表性的活动及干预，将其干扰类型与频次列入方案中。从人、机、料、法、环、测各方面综合考虑，组合出最具有代表的“最差条件”。
4、人员重大变更，是否需要进行培养基模拟灌装试验才能正式上岗？ 答：无菌药品附录中第47条：培养基模拟灌装试验的首次验证，每班次应当连续进行3次合格试验。空气净化系统、设备、生产工艺及人员重大变更后，应当重复进行培养基模拟灌装试验。培养基模拟灌装试验通常应当按照生产工艺每班次半年进行1次，每次至少一批。人员重大变更，肯定需要重新进行培养基模拟灌装试验，只有参加过模拟灌装试验的人员，才可以进入到核心灌装区进行正常产品生产的操作。
5、在培养基模拟灌装结束后，在培养时，是否所有的西林瓶都要倒置培养，还是只需要部分的倒置培养即可？ 答：只要培养基与西林瓶所有接触面接触过就可以，无论正立、倒立或平放。行内有三种做法：一是培养基模拟灌装结束，正常的培养，不需要倒置，培养基培养期间，瓶子里的任何表面都要被培养基接触到，翻转几次就可以了；二是将培养液与西林瓶和胶塞充分接触，然后一半倒立培养、一半正立培养； 三是将培养液与西林瓶和胶塞充分接触，在20-25度正立培养7天，30-35度倒立培养7天。指南征求稿中是第一种，就是培养前，对模拟灌装产品进行颠倒、轻摇以使培养基接触所有内表面，再正立培养，开始培养后不应再进行反转等干扰。我们是第二种和第三种的混合，如先将灌装制品按不同批号区分，同一批号不同板层的灌装制品也需分开放置（小批号样品一半正立放置、一半倒立放置），装入中转筐中，先置20-25℃培养7天，进行目检，将正立转成倒立，将倒立转成正立，将再置30-35℃培养7天。
6、如何判断哪些灌装样品不需要进行培养？
答：包括破损，影响到密封性的样品；完整性测试（泄漏测试）失败的样品；文件中明确规定予以丢弃的中控测试样品；设备自动剔除的样品；文件中明确规定，每次干扰后应予手工剔除的样品（规定应详细、明确，并需证明其可操作性和稳定可信性）。另外，剔除的样品应进行记录注明丢弃原因。
7、在培养基灌装试验中，是否必须进行录像？录像的保存期需要多长？ 答：不是必需的，录像仅是一种可选的辅助调查和培训手段。如果采用了录像措施，也仅作为公司内部的资料（如同内部审计报告），不必向检查员出示。公司应有文件规定，什么情况下要进行录像，录像的储存时间等。
8、是否可在培养基模拟灌装试验中模拟停电的状况？
答：不允许。停电后，核心灌装区的AB级无法保证无菌性，如果可以模拟，还要A级监测相关指标做什么？一旦A级没电，没有层流保护，无菌状态被破坏了，即使你无菌检测是合格的，毕竟检测只是仅有代表性，有其无菌检测局限性。不能以培养基模拟灌装试验中模拟停电为产品放行为借口，可考虑A级有UPS或22S内迅速转供电也是可以的。
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发表于 2016-9-5 11:20:07
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楼主
我是想分两次的，中间没找到合适断句 
