小白求教

hetaoren · 发表于 2021-8-16 14:12:15

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小白求教，纯化过程中，对于蛋白质本身如何选择挂柱还是流穿？

低调zjj · 发表于 2021-8-16 15:24:06

你这个问题挺复杂的，我做过一点纯化，抛砖引玉一下哈。
常规纯化工艺中主要是阴离子需要考虑是结合模式还是流穿模式(阳离子层析和疏水层析可能也有两种模式，亲和层析基本都是结合模式了吧)，我主要从阴离子层析方面说一下，考虑层析模式主要有4点：
1）pI值：
对一个新的蛋白，首先考虑的是蛋白的pI值了，pI值决定你阴离子层析的缓冲液pH（简单说一下：缓冲液pH高于蛋白pI时蛋白带负电荷，能够结合至阴离子填料上，原理网上能搜到）所以说一般阴离子层析pH相对较高，阳离子反之。
蛋白pI过高的话，要求的缓冲液pH更高，对蛋白稳定性可能有影响，就难以做阴离子结合模式了，可能只能做流穿模式了，或者不做阴离子，做阳离子；但是pI过低的话，就可能结合上去难以洗脱下来了。
2）杂质去除：
除了pI值外，要了解阴离子层析的作用（HCP去除、去酸性或碱性蛋白提高电荷异构体纯度、去聚体和小分子提高蛋白纯度、DNA残留、内毒素等等），一般流穿模式HCP去除效果较好，亲和下来HCP比较高的话可以考虑流穿模式；个人觉得后面几个杂质的话不是决定结合或流穿模式的主要因素。
3）载量：
一般情况下，阴离子层析结合模式的载量是要低于流穿模式的载量的，而且收率也是，结合洗脱模式的收率一般也是低于流穿模式的，就我经验而言，流穿模式的话蛋白含量损失是比较小的。
4）工艺衔接性：
最后一点的话可以考虑你阴离子层析后续工艺情况，是否好衔接后一步工艺：比如你阴离子层析流穿模式，收获的蛋白液电导很低，但是后面接疏水层析，得加好多硫酸铵或氯化钠提高电导，而且一般阴离子层析流穿样品体积很大，调电导需要的物料就比较多，生产就比较麻烦而且成本也上去了；反之，阴离子结合洗脱模式，样品电导比较高，如果后面接阳离子层析要调低电导，稀释的话体积也会比较大，也不方便放大生产。
以上四点是本人根据工作经验所得，讲得比较浅，有地方比较啰嗦，层析也是很复杂的，不是我这几句就能讲清楚的。
个人观点，如有错误之处，还请见谅

SYBK-lxp · 发表于 2021-8-16 14:33:51

蛋白等电点。
也要看需要去除什么样的杂质。如果是分子排阻的话就只有流穿。
真的需要看纯化什么样的蛋白

hetaoren · 发表于 2021-8-16 15:00:38

SYBK-lxp 发表于 2021-8-16 14:33
蛋白等电点。
也要看需要去除什么样的杂质。如果是分子排阻的话就只有流穿。
真的需要看纯化什么样的蛋白

谢谢，还请问有没有相关文献或者书籍啥的？

SYBK-lxp · 发表于 2021-8-16 15:04:55

可以关注下cytiva的公众号，里面有些讲理论的视频，讲的还是很基础的，很容易听懂

hetaoren · 发表于 2021-8-17 15:34:24

低调zjj 发表于 2021-8-16 15:24
你这个问题挺复杂的，我做过一点纯化，抛砖引玉一下哈。
常规纯化工艺中主要是阴离子需要考虑是结合模式还 ...

谢谢您的讲解

hetaoren · 发表于 2021-8-17 15:34:59

SYBK-lxp 发表于 2021-8-16 15:04
可以关注下cytiva的公众号，里面有些讲理论的视频，讲的还是很基础的，很容易听懂

这是设呢么公众号呀

SYBK-lxp · 发表于 2021-8-17 15:58:44

原来GE的公众号，你搜索一下就知道了

SYBK-lxp · 发表于 2021-8-17 15:59:26

hetaoren 发表于 2021-8-17 15:34
这是设呢么公众号呀

原来GE的公众号，你搜索一下就知道了

hetaoren · 发表于 2021-8-19 13:43:03

SYBK-lxp 发表于 2021-8-17 15:58
原来GE的公众号，你搜索一下就知道了

谢谢你的指导

yuansoul · 发表于 2021-10-13 15:54:39

hetaoren 发表于 2021-8-16 15:00
谢谢，还请问有没有相关文献或者书籍啥的？

本科毕业？

hetaoren · 发表于 2021-10-14 08:15:26

yuansoul 发表于 2021-10-13 15:54
本科毕业？

谢谢您的指导

小金库 · 发表于 2022-8-15 21:19:04

非常感谢分享