微生物检测中菌悬液不会制备，化验结果怎么能保证准确？

广东环凯微生物

对于微生物实验室的小伙伴们来说，每天除了面对接样，检测样品，配培养基等各种瓶瓶罐罐交响曲以外，制备合适浓度的菌悬液应该是每天的头号大事了，毕竟有太多的项目需要合适浓度的菌悬液，产品方法适用性，培养基促生长测试，最要命的是每天产品检测中的阳性对照菌菌悬液的制备……

一、操作流程

这里以大家最常用的大肠埃希菌为例，其它菌种方法类似。

1，菌种制备：从菌种保藏管中吸取少量菌液，转接到新鲜的TSB中，于30℃-35℃培养箱中培养18-24小时。

2，稀释：取步骤1的培养物1mL，加入到9mL的pH7.0氯化钠蛋白质缓冲液中，进行倍比稀释。

3，平板计数：取稀释好的菌液，一般取3个稀释级，每个梯度取2mL，分别加入两块90cm的平皿中，每皿加入1mL菌液，倾注45℃左右的已经经过确定的TSA培养基，轻轻摇匀，静置，培养基凝固后，置30-35℃培养箱中倒置培养48小时。

4，菌落计数：将培养后的平板，置于菌落计数器下进行菌落计数，以确定哪个稀释级的浓度能够满足测试的要求。

二、对应注意事项

1，菌种制备：也可以使用TSA平板进行培养，如果转接的是冷冻保藏管中的菌，最好再转接一次，使用第二次转接的菌种。

2，稀释：取菌液的时候，需要先对菌液进行振荡或吹打混匀，方可吸取菌液。可以不用进行倍比稀释，只要能保证最后加入到测试样品中的菌的数量符合要求即可。

3，平板计数：取菌液时同样需要先将试管中的菌液进行混匀。

4，培养基菌落计数：不建议逐日观察结果，因为平板中可能有凝集水， 逐日观察拿动平板，可能会导致水落到菌落上，菌跟着水流到下一个空白地方，导致结果不准确；另外如果是霉菌，因为有孢子，拿动也会导致孢子落到平板空白地方，影响结果。

三、事后思考

1、菌液的作用

菌悬液使用有时效性要求：

2020版《中国药典》和《欧洲药典》8.0版要求如果放置在室温，菌悬液必须在2小时内使用，如果放置在2-8℃保存，可以在24小时内使用。

那么问题来了，菌悬液的菌的数量需要在48小时后才能确定，但是在24小时之内菌悬液必须使用，所以在不知道菌含量的情况下，样品测试需要做至少三个梯度。

笔者之前在微生物实验室做了5次的菌悬液制备，为了保证实验的成功，每次都是要做三个梯度，虽然大多数都是同一个稀释级的含量符合要求，但是还是偶尔有另一个稀释级才符合要求的时候，所以笔者每次都乖乖的做三个梯度的测试，还好笔者那个时候依据的法规中，日常的无菌检查和控制菌检查中没有阳性对照的要求。

这里说的三个梯度不是说只是计数，而是菌悬液实际运用的测试中也需要三个梯度，举个例子，某个无菌产品无菌检查中的阳性对照测试，需要做三个对照。当然，同样的产品方法适用性，培养基促生长测试也是如此。流程图如下：

2、步骤的繁琐

这个流程图中，还是省略了一些步骤，一句话带过的倍比稀释，做过的小伙伴们知道，这个说起来容易做起来难。

另外在接收菌种和从冷冻保藏管中取出菌种来使用时，还需要进行相应的鉴定，所以不要觉得这个流程好冗长，其实已经是简单版的。

Apple1234567816

3个梯度也太多了吧！工作量可是增加了3倍

joshua

一般数量都是很稳定的额，每次搞3个级别 太麻烦

朱栋114

做个验证确定哪个梯度是需要的菌落数就行了呀，哪有人去做三个梯度，不要烦死啊

来自安卓APP客户端

白无鸢

下次麻烦出个详细的啊，谢谢

小金库

感谢分享。

15923526872

意思是先多做几次实验，判定那个稀释度的菌液液浓度能达到要求，后续就根据经验，直接稀释到那个梯度，取菌悬液进行实验吗

15923526872

joshua 发表于 2021-12-21 13:26
一般数量都是很稳定的额，每次搞3个级别 太麻烦

你好，我想问下你们是怎么做的呢，求教下，对于这块有点懵