细胞&基因治疗病毒载体下游纯化解决方案

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细胞&基因治疗病毒载体下游纯化解决方案

作者：汉邦科技-庆无影（BLA联合发起单位）

01行业概况
近日，行业媒体Fierce Biotech和Fierce Pharma联合推出2022年度生物医药领域“最具影响力人物榜单”，总计包含20位在生物医药领域中做出重要贡献的首席执行官（CEO）、科学家、企业家和监管专家。我们注意到榜单中的Arie Belldegrun博士，他在生物医药领域从业多年，涉及的研究领域包括抗体、免疫疗法、细胞疗法等。目前其创立的Allogene公司，主打同种异体CAR-T产品，从健康供体中获得T细胞进行基因工程改造，生成的CAR-T细胞能够被冰冻储存，在需要使用的时候就可以直接进行复苏给患者注射，这一技术也将是细胞治疗领域的又一大创新之举。
谈到细胞基因治疗（CGT）领域，相信大家都不会陌生。相较于传统的小分子和抗体药物在蛋白质水平进行调控，有一定的局限性，细胞与基因疗法可在分子层面通过基因表达，基因沉默或者体外改造的手段来实现治疗，尤其对于罕见病的治疗。继小分子、抗体类药物后，细胞基因治疗有望引导下一代治疗技术的浪潮。根据Frost & Sullivan数据与预测，2020年全球基因治疗市场规模达20.8亿美元，2016-2020年CAGR(复合年均增长率)为153.3%，预计到2025年全球基因治疗市场规模将达到305.4亿美元，2020-2025年CAGR高达71.2%。细胞基因治疗产品在肿瘤、罕见病、各类遗传病领域展现出良好的前景，市场持续扩容。



图1 CGT药物与传统药物异同



图2 资料来源：Frost & Sullivan数据整理



图3 资料来源：Frost & Sullivan数据整理

02病毒载体

细胞基因治疗生产通常可以分为质粒、病毒以及细胞三个相对独立的部分，每一个版块都有其对应的难点，比如在质粒的构建，菌库构建，递送系统的选择，细胞培养、细胞系构建等环节，单独药企很难具备产品的独立生产以及具备全部的解决困难技术的能力，更多的是需要与对应的CDMO企业进行合作，达到优势互补。正是由于复杂的技术机制、高门槛的工艺开发和大规模生产、严苛的法规监管等要求以及有限的产业化经验，使得CGT产品相比传统制药更加依赖CDMO，据相关数据统计显示CGT行业外包渗透率超过65%，远超传统生物制剂的35%。而考虑到作为核心的病毒载体的生产涉及十分复杂的工艺，难度极高，且制备周期较长，预计未来CGT的外包率仍将维持高位。

目前针对基因治疗药物的递送方式主要有两种，诸如现在比较火热的mRNA疫苗的递送就是采用LNP递送系统进行，而LNP递送系统，质粒等都属于非病毒载体。而病毒载体主要是腺相关病毒AAV，慢病毒LV和逆转录病毒RV等载体，对于基因治疗药物来说优质的病毒载体应具备有足够的空间来递送大片段的治疗基因；具有高转导效率，能感染分裂和非分裂的细胞；能靶向特定的细胞，且可以长期稳定表达转基因；具有较低的免疫原性的或致病性，不会引起炎症；具备大规模生产的能力等优点。

人工改造的病毒是目前基因治疗中最常用的载体，根据ASGCT数据，89%在研CGT项目采用病毒载体作为递送系统，腺相关病毒AAV和慢病毒LV是最为常见的载体类型，分别常用于基因治疗和CAR-T等产品。

全球病毒载体市场规模预测

图4 资料来源：Oxford BioMedica

在研CGT项目采用的病毒载体类型

图5 资料来源：ASGCT

03病毒载体生产

CGT药物生产核心是病毒载体的表达生产，通常病毒载体的生产涉及上游的载体表达和下游的分离纯化。载体的生产涉及到的工艺比较复杂，难度极高，且制备周期较长，病毒载体的产能问题是全球性问题，一定程度上阻碍了整个基因治疗行业的发展，病毒载体的产能问题也是诸多CDMO企业需要重点解决的问题。

基因治疗载体工艺的开发、放大和GMP生产涉及到复杂的生产体系和严格的质量控制体系，例如菌株库、细胞库、毒株库建库工艺等，大规模大肠杆菌发酵工艺，细胞培养工艺，病毒收获和纯化工艺、无菌工艺，制剂灌装等重要工艺。每一环节，每一步的控制对于GMP生产来说都至关重要。以下是对病毒载体的生产工艺流程做的简要梳理。

图6 病毒载体的生产工艺流程

在经过细胞培养、病毒载体转染、病毒载体细胞扩增放大培养等上游（USP）环节后，我们可以得到粗液，此时还需要进行一系列下游(DSP)工艺如澄清，浓缩和纯化等步骤来获得最终产品。上游工艺与下游工艺之间既相互独立又存在互相影响，上游粗液质量的好坏直接决定了下游处理的难易程度。目前对于病毒载体下游环节主要会涉及到澄清，浓缩，洗滤，纯化，精制，除菌过滤等步骤，如下图所示：



图7 病毒载体下游工艺

对于下游（DSP）处理环节来说最核心的步骤是纯化，它直接关系到产品的质量问题，对于纯化环节来说目前主要有以下四个方面的难点需要进一步解决：
（1）病毒本身体积较大，层析纯化过程中的可接触面积较小，会影响和配基的结合；
（2）精纯过程中对于杂质去除的考量：上样量；样品中杂质成分（HSP、核酸酶、降解后的DNA）的大小，还需要根据病毒大小对应选择不同的层析方式。目前病毒载体DSP整体收率基本在20-30%。
（3）在浓缩环节通常需要对大体积的粗液进行浓缩，通常需要将200L-500L体积生物反应器操作获得的料液浓缩到100-200mL，具备一定的挑战性；
（4）上游环节中的空壳病毒问题也会对下游处理产生影响，因为空壳病毒和完整病毒从物理角度高度相似，很难通过下游工艺方法来进行区分。
04病毒载体纯化

腺相关病毒AAV一般会采用亲和层析加离子交换这样的两步层析法来对病毒载体进行纯化。

图8 腺相关病毒AAV纯化工艺

慢病毒LV在进行大规模下游处理的时候一般会经历：

1、从粗制或澄清细胞培养液中初步纯化捕获目标载体，并消除主要污染物；

2、中间纯化处于捕获和精纯阶段之间，主要去除特定的杂质（蛋白质、DNA和内毒素）；

3、最后是精纯，旨在去除痕量污染物和杂质，以适合制剂的形式产出活性产品。

图9 慢病毒载体下游工艺

无论是腺相关病毒AAV还是慢病毒载体LV在经历下游处理的过程中一般都需要经历离子交换/亲和层析等色谱纯化方法，而且我们一般需要使用切向流过滤设备来对我们的粗品溶液进行过滤和浓缩来确保我们可以最终获得目标产品。

汉邦科技近年来也在密切关注细胞基因治疗行业的发展，相对于疫苗，单抗等客户更多自主进行加工生产，细胞基因治疗领域由于技术的复杂性和生产成本问题，更多客户是选择外包的形式进行生产，我们也希望与国内细胞基因治疗领域的CDMO企业一起携手合作，将更多优质产品推向市场，走向世界。

【关于汉邦科技】

江苏汉邦科技有限公司，成立于1998年，是集研发、生产和贸易为一体，以色谱产品为核心的国家级重点高新技术企业。主要产品有：实验室高效液相色谱系统、工业制备液相色谱系统、模拟移动床色谱系统、连续离交色谱系统、超临界流体色谱系统、生物制药下游纯化设备及提供以色谱产品为核心的整体化解决方案与服务。药明康德与君联资本、红杉资本先后入股汉邦科技，进一步推动公司在生物医药行业的发展。

公司现有员工500余人，其中：博士、硕士40多人，大学以上学历人员占员工总数80%以上。先后成立 “江苏省生物化学过程工程技术研究中心”、“江苏省工业制备色谱工程中心”、“江苏省企业研究生工作站”和“江苏省博士后创新实践基地”，2020年获批国家专精特新“小巨人”称号。建立了一支集纯化工艺、分离材料、机械设计、软件设计等多专业60多人的专职研发团队，构建了一个强大的“产、学、研、用”平台，汇聚了一批专家、学者，可为客户提供从产品定制到工艺开发、工程设计、总装调试和系统验证的交钥匙工程。

公司先后承担国家和省级项目20多项，拥有200多项知识产权成果，建立了生产过程质量可追溯体系，从原料采购、加工制造、质量检验和安装售后每一个环节严格管控，保证产品符合GMP、cGMP及FDA等法规要求。先后通过ISO9001质量体系认证、ISO14001环境体系认证、OHSAS18001职业健康体系认证、欧盟CE认证和ATEX防爆认证。

【关于BLA】

生物制药国产化推进联合会，英文全称Biopharma Localization Association，缩写BLA。由生物制药研发、生产企业及服务商（含生物制药上下游各细分领域）等共同发起组成，联合会为推

动生物制药国产化而生。BLA目标：使BLA成为中国生物制药企业信赖的组织。BLA，for Biopharma，for China.

入会咨询：杨老师，13788930955（微信注明：BLA）

xqliu

学习了，谢谢提供分享。

君临沧海

dasheng1980

谢谢楼主分享

aiyxer

你们都是这么做的吗