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CAR-T细胞制备工艺中的无菌保障，过去、现在和将来
自2017年首个CAR-T细胞制剂（Kymriah）上市至今，行业内，但凡提到CAR-T细胞疗法，哪怕没有详细了解，也至少是知道这是一项高端科技、前沿疗法。行业外，你说120万一针的天价药，也基本上快到了家喻户晓的程度。之所以能在行业内外引起轩然大波，价格昂贵是其一，更多的是因为CAR-T细胞产品的特殊性：活体细胞，来源于病患，定制化产品，一对一生产，一对一治疗，治疗后的临床随访等等。 作为一个如此“特殊”的产品，其制备工艺也一直是行业内的一大难题。常规CAR-T细胞制备工艺的主要流程包括患者单采血、PBMC分离及T细胞分选激活、T细胞改造（CAR序列导入T细胞）、改造后的T细胞（CAR-T细胞）扩增、细胞收获及制剂分装冻存。细胞的结构大小和活体性质决定了CAR-T细胞制剂整个制备流程无法进行除菌和灭菌，也就是说，从PBMC分离步骤开始就必须保证全流程的无菌操作、封闭转移等。 对于CAR-T细胞制剂生产环境的要求，国家药监局综合司在年初发布的《细胞治疗产品质量管理指南》（试行）中明确了关于各种细胞制备工艺流程的不同洁净级别要求。《细胞治疗产品质量管理指南》（试行）以下简称《指南》。 | 洁净度级别 | | | 1.处于未完全密闭状态下的生产操作和转移； 2.无法除菌过滤的溶液和培养基的配制； 3.载体除菌过滤后的分装。 | | 1.生产过程中采用无菌注射器对处于密闭状态下的产品和生产用溶液进行穿刺取样等操作； 2.病毒载体生产用细胞的传代操作； 3.可除菌过滤的溶液和培养基的除菌过滤； 4.载体的除菌过滤。 | | 1.可除菌过滤的载体的纯化操作； 2.可除菌过滤的溶液和培养基的配制。 | | 1.采用密闭管路转移产品、溶液或培养基； 2.采用密闭系统或设备进行细胞产品、载体的生产操作（如在隔离器中进行产品的无菌分装）、取样； 3.质粒生产用工程菌或病毒载体生产用细胞在密闭罐中的发酵或培养。 |
不难看出，法规层面较为认可的无菌保障策略是密闭系统操作，操作系统的密闭性效果越好，对环境洁净度的要求越低，反之，未完全密闭状态下的生产操作和转移则需在B+A的环境中进行。近些年来，布局细胞治疗产品的企业逐年递增，产品所处阶段从初步研发到上市阶段都有，生产线根据设备的不同或自动化程度的不同，大致分为3种不同的阶段：“B+A”纯手动模式，C级环境半自动模式，D级环境全自动封闭系统。 1. “B+A”纯手动模式，生物安全柜作“主力” “B+A”模式也是目前应用最为广泛的，“B”是指B级环境，“A”一般采用生物安全柜控制。所有非完全密闭操作均需在生物安全柜中完成，比如细胞的分离、转移、混匀等。该模式下各工序步骤主要运用到的设备如下表： 生物安全柜作为使用频率最高的设备之一，其作用的关键性不言而喻。从产品质量控制和环境维持角度，生物安全柜必须控制操作台面内部的环境达到A级要求，同时排出的气体多数情况下直接排入房间内部，不能对环境产生影响。其次，由于细胞治疗产品的特殊性，病人来源的血液样本可能存在阳性样本，从操作人员安全的角度考虑，操作过程气流不能通过操作窗口溢出，生物安全柜内的气体必须经过过滤才能排放。 手动操作的不确定因素或人为引入的污染的可能性是最大的，非密闭系统产生污染与交叉污染的风险也是最大。《指南》中也明确规定，为了更好的控制质量风险，采用非密闭系统或设备进行生产时，同一生产区域内不得同时生产不同品种的细胞产品，同一生产操作间内不得同时生产相同品种的不同批次细胞产品。尽管如此，现阶段该模式目前仍是普及最广，应用最多的。该模式下需要确保最终产品的无菌性，重点需要注意B级环境的维持（包括空调系统、环境清洁消毒等方面）、操作人员的无菌意识（更衣确认等）、关键设备（如生物安全柜、培养箱等）的选择以及整体工艺的设计。 2. C级环境半自动模式 纯手动模式属于较为传统细胞制备工艺，为更好的提升工艺的稳定性，近年来针对不同操作工序还出现了一系列的半自动细胞处理设备，一台设备可以单独完成一个操作单元，前后不同操作单元之间的连接、转移通过工艺设计如接管机封管机、无菌快接等方案在C级环境下实现。半自动模式下，产品的无菌控制策略更多的依赖于设备（耗材）的可靠性，工艺设计的合理性。 | 工序步骤 | | | Sepax C-Pro，sefia S-2000，CliniMACS Plus，Ekko，Elutra，Rotea，Ksep | | | | | | |
3. D级环境全自动封闭系统 CAR-T细胞制备的一对一生产的批量要求，UCAR-T的大规模生产需要，在纯手工操作和半自动系统两种模式下都难以实现，全自动封闭系统可以说是CAR-T细胞生产的最终归宿。这类设备有CellSep Pro，Cocoon，CliniMACS Prodigy等，在1台设备内完成从PBMC分离、细胞分选到最终的细胞收集全过程，不用担心不同操作单元之间繁琐的衔接，也没有非密闭系统操作条件下污染与交叉污染的高风险。理论上此类设备在实验室环境下运行都不会对产品的无菌性产生挑战，为更合理合规的进行生产管理，《指南》中明确，采用密闭系统或设备进行细胞产品的生产需在D级条件下进行。 全自动封闭系统将细胞制备过程受污染的风险降到了最低，无菌保障对于设备和一次性耗材的依赖性最高。可以在统一操作间生产不同批次和不同品种的细胞，更大的风险在于相互间的混淆，应采取有效的措施避免物料、产品和废弃物的差错和混淆，如房间压差控制、人员管控、交替操作、定置管理、灭菌与消毒以及单向流传递等。 最后，作为一个非最终灭菌产品，随着自动化程度的提升，无菌性受到的挑战逐步降低，对环境的要求也在逐步降低。但是，不论是纯手动操作还是全自动化模式，对于设备（或耗材）无菌性能的依赖程度是不变的，生物安全柜必须能保障持续提供A级环境，全自动封闭系统必须确保系统（耗材）的密闭性、无菌性。期待更多更稳定的封闭系统在CAR-T细胞制备工艺中的应用。
由于本人学识水平有限，如有描述不合理之处，敬请指正。
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发表于 2023-8-10 22:40:20
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发表于 2023-8-11 08:28:33
楼主
哈哈，感谢指正