分子克隆原理+注意事项以及目的基因表达

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同源重组原理

同源重组(homologous recombination)是指两个完全同源或部分同源的DNA分子片段在体外进行重组的过程。它依赖于同源臂(homology arm),即两个DNA分子同源区的DNA序列。

质粒构建中，同源重组构建特定的序列在3'或5'端带有酶切位点的质粒。

其基本原理如下：
1.引物设计和片段扩增：构建特定的质粒和目标DNA的序列，设计引物帮助扩增目标DNA的序列。引物设计的时候，在引物的3'端或5'端需添加限制酶切位点，便于后续的克隆操作。

2.目标基因片段扩增：采用PCR方法扩增目标基因片段，加入限制酶切位点。

3.线性化质粒：使用限制酶酶切将质粒线性化。

4.同源臂连接：将扩增的目标基因片段与线性化质粒连接，完成同源重组，随后在质粒中插入目标序列片段。

5.质粒筛选：重组后转化至宿主中，利用酶切和测序方式鉴定，筛选出合适的质粒。

分子克隆原理

分子克隆技术可以将DNA片段与载体共价连接起来，随后引入到寄主细胞中，筛选出具有重组的克隆。

首先设计引物,选择目的蛋白相应地核酸序列,根据需要设计特异性引物分子。随后进行酶切鉴定及测序比对。实验流程如图。

载体类型及克隆能力：
1、腺病毒容量7kb
2、慢病毒容量6kb（外源基因大于2kb难度增加，毒性蛋白、凋亡蛋白、膜蛋白不适用。）
3、AAV容量4kb（目的基因大于2kb，需要去掉内含子）

表达质粒：
原核表达：体外纯化蛋白
真核表达：体内细胞选用

载体选择—注意事项

1、无起始密码子和终止密码子的基因，在插入无标签的载体时需要加入起始密码子和终止密码子。
2、带有标签的载体N端，需要加入终止密码子建议少次数的翻译载体序列。
3、带有标签的载体C端，需要加入起始密码子且注意需要去掉终止密码子。
4、质粒选择1.5kb左右，不容易损坏且易于拷贝。
5、选择时载体必须具有不少于一个的酶切位点。
6、抗性基因需携带易于检测的标记物。
7、腺病毒载体，只需带单个标记的荧光蛋白。
8、AAV载体，单个荧光蛋白标记即可。
9、编码蛋白的目的基因过表达，需要带常见标签融合表达。

传统克隆—无缝克隆

传统克隆-难点如下：
1、使用相同内切酶对载体和片段线性化，产生粘性末端进行线性化的载体和片段连接。
2、选择好的酶、连接时间不能过短、15度左右的连接温度、做好转化对照。
3、15度过夜后，4度培育几天。
4、采用单个片段连接。
5、采用双酶切可降低背景提高阳性率。
6、DNA和酶的GC在50%左右。

无缝克隆-技术优势：
1、酶切位点适用多种载体和片段。
2、阳性率高。
3、连接快、耗时短。
4、适用于多片段克隆。
5、不依赖于限制性内切酶。
6、酶切位点不会引发片段之间的间隔问题。

目的基因表达“转染方法”+“鉴定”

质粒转染：
1、磷酸钙：适用于易转染细胞类型—操作复杂
2、电转染：适用于难转染细胞类型—操作复杂、成本高
3、脂质体转染：适用范围广泛—细胞具有毒性

病毒感染：
1、腺病毒：适用于原代细胞—不适合筛稳转
2、慢病毒：适用于难转染细胞类型、适合筛稳转—细胞具有毒性
3、逆转录病毒：适合筛稳转—载体容量小

表达鉴定：
1、蛋白：WB—检测蛋白表达变化
2、RNA：qPCR—检测RNA表达变化
3、间接检测：miRNA封闭—检测蛋白表达变化间接反应检测miRNA表达的变化

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学习了，谢谢提供分享。