工作菌株怎制备

@王不留行

有没有对菌株复苏、保存这块比较熟悉的，我想请教一下，各位朋友帮帮我

156067

随便找个卖培养基的供应商，看他们官网，基本都有传代保存的说明

咒逐

哪个菌株，什么用途，速速报来

@王不留行

咒逐 发表于 2024-9-24 11:42
哪个菌株，什么用途，速速报来

留个联系方式

咒逐

@王不留行 发表于 2024-9-24 13:16
留个联系方式

有问便问，私聊不方便混赞
坛友们还是很大方的，你要啥就直说，我没有的，有的是人有。但是，个人联系方式泄露容易被盒。
实在接受不了，自己可以去地方行业群里要前辈们的V，地方行业群开行业培训、会议之类时候记得加就是。

@王不留行

咒逐 发表于 2024-9-24 14:34
有问便问，私聊不方便混赞
坛友们还是很大方的，你要啥就直说，我没有的，有的是人有。但是，个人联 ...

我用磁珠冻存一批菌株（金葡，大肠。白念，铜绿），
假如我每天要做阳性试验，加小于100cfu的菌，这个菌是磁珠复苏后的纯培养物吗，具体怎么操作，我是不理解这个操作过程，
（磁珠复苏培养后的纯培养物，做成多支斜面冷藏冰箱，做阳性试验时我取一支往样品加菌使用）我原是这么理解的，不知正不正确？这个斜面是工作菌株吗

（、

@王不留行 发表于 2024-9-24 16:12
我用磁珠冻存一批菌株（金葡，大肠。白念，铜绿），
假如我每天要做阳性试验，加小于100cfu的菌，这个菌 ...

斜面只是做为传代和做菌液，你用斜面做菌液，再确认浓度，然后这个菌液做保存时间验证，你就有菌液天天用啦。

shengwu042

斜面用于传代和菌种短时间保存的（一般一个月），瓷珠是用于菌种长期保存的（一般-20℃下一年），工作菌液是将瓷珠或斜面挑取的菌加入增菌液中培养后逐级稀释为你所需要的浓度（如10^5cfu/mL、10^6cfu/mL等），稀释后的菌悬液一般2h内使用，或2~8℃保存24h内使用（药典1105），你可以自行验证浓菌液的保存期限和保存条件。比如菌种A的浓菌液在0~4℃冰箱冷藏保存7天内，逐级稀释到某一级的浓度都能达到10^6cfu/mL，都比较稳定，那么以后你就可以采用这个保存期限来做稀释菌液。

@王不留行

（、 发表于 2024-9-24 16:23
斜面只是做为传代和做菌液，你用斜面做菌液，再确认浓度，然后这个菌液做保存时间验证，你就有菌液天天用 ...

菌悬液是怎么做的，TSB液体培养基可以吗

@王不留行

shengwu042 发表于 2024-9-24 16:33
斜面用于传代和菌种短时间保存的（一般一个月），瓷珠是用于菌种长期保存的（一般-20℃下一年），工作菌液 ...

理解了一点，那这个工作菌液一次制备一支冷藏多次使用，还是制备多支冷藏一次试验用一支

shengwu042

@王不留行 发表于 2024-9-24 16:40
理解了一点，那这个工作菌液一次制备一支冷藏多次使用，还是制备多支冷藏一次试验用一支

我理解的工作菌液是稀释到适宜浓度加到供试品或缓冲液里的，这个一般最多保存24h，超过再用就不准了，我们一般都是临用新制的。我指的是稀释前，增菌后的浓菌液，可以做个保存期限的验证。浓菌液用一颗瓷珠做一支就行。验证好保存期限，期限内可以都用这一支做稀释级。

（、

@王不留行 发表于 2024-9-24 16:40
理解了一点，那这个工作菌液一次制备一支冷藏多次使用，还是制备多支冷藏一次试验用一支

这是浓菌液，用的时候取0.1ml用，在有效期内

@王不留行

shengwu042 发表于 2024-9-24 16:47
我理解的工作菌液是稀释到适宜浓度加到供试品或缓冲液里的，这个一般最多保存24h，超过再用就不准了，我 ...

明白了，总算理清晰了，我取一颗磁珠加到液体培养基中培养后这一支就是（浓菌液），把这支浓菌液放到冷藏（假如我验证的保存期7天），在这7天内，只要我做试验用菌就取这一支浓菌液，来稀释我需要的浓度（工作菌液），假如我取浓菌液0.1ml，取完我又冷藏第二天继续用这一支浓菌液稀释对吗

@王不留行

（、 发表于 2024-9-24 16:47
这是浓菌液，用的时候取0.1ml用，在有效期内

浓菌液2—8℃冷藏，一般能保存几天

shengwu042

@王不留行 发表于 2024-9-24 17:59
浓菌液2—8℃冷藏，一般能保存几天

不同菌种保存条件和时间都不同，需要自行验证，验证方法可以参考https://wenku.baidu.com/view/575ac62f7b3e0912a21614791711cc7931b778ef.html?_wkts_=1727225460599&bdQuery=%E8%8F%8C%E6%B6%B2%E5%8F%AF%E4%BB%A5%E4%BF%9D%E5%AD%98%E5%A4%9A%E4%B9%85&needWelcomeRecommand=1

其他参考文献：https://wenku.so.com/d/4781d3dd325b2c32efb2dea24101db7a

https://d.wanfangdata.com.cn/periodical/zgjcyy2014z1013

https://xueshu.baidu.com/usercenter/paper/show?paperid=1f0b08r0vg2v0r100x730p10tw337985&site=xueshu_se

@王不留行

shengwu042 发表于 2024-9-25 08:51
不同菌种保存条件和时间都不同，需要自行验证，验证方法可以参考https://wenku.baidu.com/view/575ac62f7 ...

非常感谢分享，学习了

wyliu

参考：
2023药品GMP指南：质量控制实验室与物料系统--12章 微生物实验室质量管理和检验
《中国药典》（2020年版）第四部

（、

@王不留行 发表于 2024-9-24 17:04
明白了，总算理清晰了，我取一颗磁珠加到液体培养基中培养后这一支就是（浓菌液），把这支浓菌液放到冷藏 ...

是的

咒逐

@王不留行 发表于 2024-9-24 16:12
我用磁珠冻存一批菌株（金葡，大肠。白念，铜绿），
假如我每天要做阳性试验，加小于100cfu的菌，这个菌 ...

磁珠保存的是保存菌株，不是工作菌株。工作菌株和保存菌株最大区别主要是保存条件、实际核心差别是生物活性。直接解冻之后的菌株活性是有问题的，正常6h浑浊的，可能会被延迟至8-12h，这个特点在检验方面影响，主要会导致菌落晚长出，也就是可能存在3d、5d计数差异过大的情况，会直接影响计数结果。

100cfu，请看药典1101、1105的相关原文：“取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌的新鲜培养物，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液；”，实际是使用磁珠重新孵育复壮后的菌液作为原液、稀释成的菌液，这个描述是没有问题的。菌液在培育到一定时间后达到稳定浓度。还记得微生物生长曲线四阶段吗？准备期、指数期、稳定期、衰亡期。在稳定期内浓度相对一致，则培养时间足够、稀释步骤和手法正确、就必定能获取符合要求的菌液。

几个细菌中，大肠埃希菌、铜绿假单胞菌活性较强，适量菌种下，10h甚至更早即能到稳定期，枯草芽孢杆菌略晚，12h-15h左右，我实验室是控制在18-24h后全部取出稀释，菌数非常稳定。
如果是白色念珠菌，这是个例外，因为其生长缓慢、甚至很难在SDB培养液中悬浮，则主要办法是培养2d之后，通过振荡仪使其充分摇匀后才用比浊仪获得大致菌数，控制稀释倍数，使其理论稀释结果在200左右，就能比较好的得到50-80左右菌液（PBW，也就是pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液的比重比SDB更小，更容易发生沉淀影响最终稀释结果，使用PBW稀释时需要预设更大的稀释结果）


至于使用磁珠，个人建议不要做菌液的效期，液体培养基营养还是太少了，隔绝氧气保存（液体石蜡法）又会影响活性，每天都要用每天培养便是，下班前做一个，下午正好使用。
如果磁珠比较少，那么使用琼脂斜面培养法也是一样的，可以延长至1-2个月左右，琼脂营养就不是液体培养基可比的了，同时琼脂限制了菌体自我运动范围、相对液体的布朗运动生长更缓慢、保存时间更长。使用时仍然是需要复壮的。