请教关于对比中国药典和USP关于纯化水微生物检查方法等效性验证的实验设计

shadowhow

我们公司新建纯化水系统，在做PQ，微生物检查准备采用CP的方法。但同时想通过对比CP和USP纯化水微生物检查方法，得出CP的方法和USP方法等效，甚至是优于USP方法，
这样纯化水系统可以同时满足CP，EP，USP标准
不知道为啥传不了附件，只能将内容粘到帖子里

1.     概述 Introduction

1.1.     此VP方案是为了比较USP、EP、CP中纯化水微生物检验方法的等效性，根据验证结果，选取回收率较高的检验方法，作为技术有限公司GMP制剂实验室的纯化水系统（PWS）PQ和日常监控的微生物检测方法，从而确保该制剂实验室纯化水系统能满足GMP要求和CP, EP及USP相关标准。

The VP is used to compare the equivalence of purified water microbial test method among USP, EP, CP. According to the results of the validation, select the compendial test method with higher recovery rate as the microbial detection methods of the Performance Qualification and the daily monitoring for the purified water system (PWS) located in the  GMP Drug Product Lab, and to ensure the purified water system of GMP Drug Product Lab can meet the standard of the GMP requirements as well as CP, EP, USP.

1.2.     验证小组由工程部、GMP制剂实验室、QA人员及合同实验室组成。

The validation team is made up of the engineering department, the GMP Drug Product Lab, the QA personnel and the contract laboratory.

2.     目的Objective

2.1.     通过对比USP、EP、CP中纯化水系统微生物检测方法的等效性以及回收率，确定纯化水微生物检验方法。确保GMP制剂实验室纯化水系统（PWS）的检测符合GMP要求和CP, EP及USP相关标准。

By comparing the equivalence and the recovery ratio of microbial test methods for purified water system among USP, EP, CP, select the purified water system microbiological test method and ensure that the microbial testing of the purified water system (PWS) in the GMP Drug Product Lab is in compliance with the requirements of GMP as well as the standards of CP, EP and USP.

1.     验证内容、方法及结论Qualification contents, method and conclusion

1.1.     描述

取三个不同批号的纯化水用薄膜过滤法检测微生物限度，通过比较试验菌在R2A和PCA培养基的恢复生长结果评价整个检验方法的准确性、有效性，通过计算回收率来判断检查方法是否有影响，通过验证来确认薄膜过滤法是适合于纯化水需氧菌总数的测定的最佳方法。三次试验中，稀释剂对照回收率应在50%~200%范围内，试验组回收率也应在50%~200%范围内。进行微生物限度检查方法（薄膜过滤法）验证时，所有的平皿和稀释剂都应该严格灭菌消毒、灭菌，确保对试验结果没有影响。

Description

Membrane filtration method was used to detect the microbial limit in three different batches of purified water.  Comparative test of recovery growth of bacteria in R2A and PCA medium was used to evaluate the accuracy and validity of the test method. The recovery rate was calculated to evaluate the effectiveness of the method and through validation to confirm that the membrane filtration method is suitable to test the total aerobic counts in purified water.  In the three tests, the recovery rate of control diluent should be in the range of 50%~200%, and the recovery rate of the test group should also be in the range of 50%~200%. When the microbial limit test method (membrane filtration method) is verified, all the plates and the diluent should be strictly sterilized, to ensure that the test results are not affected.

USP、EP、CP纯化水微生物检验方法对比：

Difference of purified water microbial test method in USP, EP, CP

项目 Item	USP	EP	CP
检查方法 Method	注皿法或薄膜过滤法 Plate count or membrane filtration	薄膜过滤法 membrane filtration	薄膜过滤法 membrane filtration
培养基 Medium	PCA or R2A	R2A	R2A
适用性检查验证菌种 Strains of growth promotion test	铜绿假单胞菌Ps， Pseudomonas aeruginosa 枯草芽孢杆菌Ba Bacillus subtilis	铜绿假单胞菌Ps， Pseudomonas aeruginosa 枯草芽孢杆菌Ba Bacillus subtilis	铜绿假单胞菌Ps， Pseudomonas aeruginosa 枯草芽孢杆菌Ba Bacillus subtilis
培养温度，时间 Temperature and time	30~35℃ 48h~72h	30~35℃，5 days	30~35℃，5 days
回收率合格标准 Recovery	0.5~2.0	0.5~2.0	0.5~2.0

1.1.     菌种：枯草芽孢杆菌，铜绿假单胞菌。

Strain: Bacillus subtilis; Pseudomonas aeruginosa

1.1.1.     菌液制备：取枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌琼脂斜面上取1接种环菌，接种至10 mL TSB培养基中，30~35℃培养18~24h。

Preparation of bacteria liquid: take the Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa agar slant with 1 micro-loop bacteria, inoculated to 10 mL of TSB culture medium, incubate at 30~35℃ for 18~24h.

1.1.2.     菌液计数：取枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌不同稀释度菌液0.1 mL接种至TSA培养基，用涂布棒快速地将其涂布均匀，平行制备2个平皿，30~35℃培养48~72h计数。

Count of colony: spread 0.1 ml of Bacillus subtilis bacillus/Pseudomonas aeruginosa in different dilution to TSA medium, the parallel of two dishes are used, incubate at 30 to 35℃ for 48~72h.

1.1.3.     菌落计数结果：

Colony count result:

菌种名称 Strain name	制备日期 Prepared date	稀释度 Dilution	菌落数（cfu） Count(cfu)	平均值 Average
枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis
铜绿假单胞菌 Pseudomonas aeruginosa

1.2.     供试品制备

Test solution preparation

1.2.1.     试验组：在薄膜过滤器中加入100 mL pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液，取纯化水1 mL及不大于100cfu的菌液，注入薄膜过滤器，过滤，平行制备2个平皿。

Test group: Add 100 mL of pH7.0 Sodium Chloride-Peptone Solution, add 1 ml of sample and not more than 100cuf of bacteria liquid, filter immediately, parallel of two dishes.

1.2.2.     供试品对照组：在薄膜过滤器中加入100 mL pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液，取纯化水1 mL，注入薄膜过滤器，过滤，平行制备2个平皿。

Test Control Group: Repeat steps in Test Group but not add strains.

1.2.3.     稀释剂对照组：在薄膜过滤器中加入100 mL pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液，取不大于100cfu的菌液，注入薄膜过滤器，过滤，平行制备2个平皿。

Diluent Control Group: Use pH 7.0 Sodium Chloride-Peptone Solution in place of the sample and repeat steps in Test Group.

1.2.4.     菌液组：在薄膜过滤器中加入100 mL pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液，不大于100cfu的菌液，注入薄膜过滤器，过滤，平行制备2个平皿。

Inoculum Control Group：Repeat steps in Test Group but not add sample.

1.3.     试验结果

1.3.1.     试验组的菌落数回收率（%）=（试验组的平均菌落数-供试品对照组的平均菌落数）/菌液组的平均菌落数*100%

Test Group recovery (%) = The average colony number of Test Group - The average colony number of Test Control Group)/ the average colony number of Inoculum Control Group*100%.

1.3.2.     稀释剂对照组的回收率（%）=稀释剂对照组的平均菌落数/菌液组的平均菌落数*100%

Diluent Control Group recovery (%) = The average colony number of Diluent Control Group / the average colony number of Inoculum Control Group*100%.

1.3.3.     枯草芽孢杆菌回收率：The recovery of Bacillus subtilis

培养基Medium：

批号Lot：

样品名称 取样日期 Sample Name/ Sampling date

菌落数（cfu）Colony count (cfu)

试验组回收率Test Group recovery

稀释剂对照组回收率Diluent Control Group recovery

试验组 Test Group

平均值 Average

菌液组Inoculum Control Group

平均值Average

供试品对照组Test Control Group

平均值Average

稀释剂对照组Diluent Control Group

平均值Average

1

2

3

培养基Medium：

批号Lot：

样品名称 取样日期 Sample Name/ Sampling date

菌落数（cfu）Colony count (cfu)

试验组回收率Test Group recovery

稀释剂对照组回收率Diluent Control Group recovery

试验组 Test Group

平均值 Average

菌液组Inoculum Control Group

平均值Average

供试品对照组Test Control Group

平均值Average

稀释剂对照组Diluent Control Group

平均值Average

1

2

3

结论:Conclusion

确认人/日期 Confirmed by/date

QA复核人/日期 QA reviewed by/date

1.3.4.     铜绿假单胞菌回收率：The recovery of Pseudomonas aeruginosa

培养基Medium：

批号Lot：

样品名称 取样日期 Sample Name/ Sampling date

菌落数（cfu）Colony count (cfu)

试验组回收率Test Group recovery

稀释剂对照组回收率Diluent Control Group recovery

试验组 Test Group

平均值 Average

菌液组Inoculum Control Group

平均值Average

供试品对照组Test Control Group

平均值Average

稀释剂对照组Diluent Control Group

平均值Average

1

2

3

培养基Medium：

批号Lot：

样品名称 取样日期 Sample Name/ Sampling date

菌落数（cfu）Colony count (cfu)

试验组回收率Test Group recovery

稀释剂对照组回收率Diluent Control Group recovery

试验组 Test Group

平均值 Average

菌液组Inoculum Control Group

平均值Average

供试品对照组Test Control Group

平均值Average

稀释剂对照组Diluent Control Group

平均值Average

1

2

3

结论:Conclusion

确认人/日期 Confirmed by/date

QA复核人/日期 QA reviewed by/date

2.     验证结论：

Validation Conclusion

验证项Validation Item	方法验证Method Validation
是否通过Pass or Not	□是Yes □否No
验证结论Validation Conclusion:
确认人/日期Confirmed by/date	QA复核人/日期QA reviewed by/date

hongwei2000

有点搞笑哈
你弄这些菌是你水中的菌吗
纯化水中菌较少可能看不出来
你用你的纯化水的原水做一下检测的统计再比较看看
USP中有要求根据你的水质情况进行培养基的筛选
而不是固定用哪种培养基

shadowhow

有点搞笑哈
你弄这些菌是你水中的菌吗
纯化水中菌较少可能看不出来
[/quote]
我对药典研究的不多，见笑了
非常感谢你的建议。
还想请教一下，用纯化水的原水参照USP的方法检查吗？培养基用PCA和R2A吗？一般需要检查多少个水样做统计？
问题有点多，请多指教，谢谢

hongwei2000

我对药典研究的不多，见笑了
非常感谢你的建议。
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没有必要一定用原水
只不过原水看起来更明显而已
毕竟原水制成纯化水过程中有些菌易保留有些不保留
也就是说在原水中可能是以A菌为主
但纯化水中以B菌为主
所以最终还是要以纯化水筛选为准
必要的话要加大样品量以提高检验分辨率
即不要一堆<1cfu
至于说样本量
由于不同季节水质是不同的
建议一个大周期（即3个PQ）的比较
但不需要所有点
可以在第三个阶段选择有代表性的点