微生物快速鉴定_分型技术在食药源性微生物检测中的应用

yangcc

了解下
分析微生物的蛋白
质指纹图谱完成微生物的检测、分型，进一步提
高了检测的效率和准确性。另外，基因芯片技术、
变性梯度凝胶电泳、生物传感器等技术、随机引
物扩增多态性及免疫技术等都在微生物检测领域
得到了不同程度的应用。

本文综述传统方法和现代分子生物学鉴定、
分型技术在食品、药品微生物检测领域的应用及
进展，为提高现有检测标准、开发新的检测方法
提供参考。

1    PCR
PCR
是一种体外快速扩增特定
DNA
片段的技
术。
PCR
技术自
1983
年被
Mullis
发明以来已经在
医疗卫生、环境监测、现代农业等多个领域得到
了广泛的应用，其基本原理是在体外将引物和目
标
DNA
经过变性、退火和延伸
3
个步骤实现对目
标
DNA
的快速、特异性扩增。耐热
DNA
聚合酶
的出现极大促进了
PCR
技术的发展。
PCR
技术在
实际工作中通常与核酸测序技术相结合确定微生
物的基因型。
16s r DNA
可以显示微生物独有的进
化信息，在微生物中表现为广泛的保守型和序列
的多态性，其基因序列已经成为微生物分类鉴定
的重要依据之一。目前，
PCR
技术已经衍生出多
种相关技术应用于微生物分型及检测领域。

1.1   
多重
PCR
普通
PCR
仅在反应体系中加入一对引物，一
次反应可扩增一个目标基因片段。多重
PCR
又称
多重引物
PCR
，是近年来出现的一种一次能够检
测多种模版的新方法，其基本原理和操作程序与
常规
PCR
相同，只是在反应体系中加入多对特异
性的引物。多重
PCR
可同时检出多种致病菌或对
同一致病菌的多个亚型进行分类，也可以通过检
测微生物的致病性基因判断微生物的致病性。多
重
PCR
可以显著提高检测效率和降低检测成本，
在食品、药品微生物检测领域得到了广泛的应用。

卫沛楠等
[1]
利用建立的多重
PCR
方法检测了
144
株食源性金黄色葡萄球菌的
9
种肠毒素基因，
并对其分布情况进行了分析，结果发现多重
PCR
方法快速、简便，且特异性较高，对金黄色葡萄
球菌肠毒素基因的分布研究具有明显的优势。滕
要辉等
[2]
建立的多重
PCR
方法经过
4 h
的增菌培养
即可从速冻水饺中同时检出起始菌数
100 CFU·g
1
的沙门菌和金黄色葡萄球菌，且检测的特异性为
100%
。张政等
[3]
采用热裂解法提取金黄色葡萄球
菌、沙门氏菌和蜡样芽孢杆菌
DNA
作为模版，建
立了多重
PCR
方法，在
6  h
内即可完成检测，检
出限达到
104  CFU·m L
1
。同时，笔者也正在开展
多重
PCR
技术快速检测药品中大肠埃希菌、金黄
色葡萄球菌和沙门氏菌的相关研究工作。

虽然多重
PCR
技术已经得到广泛的应用，但
是这种方法也存在不足，如敏感性相对普通
PCR
低、扩增条件需要摸索及不同引物之间容易发生
干扰等。对于检测过程中产生的假阳性和非特异
性扩增要引起重视，以免引起误检。

1.2   
免疫捕获
PCR(immuno-capture PCR
，
IM-PCR)
IM-PCR
技术是一种把抗原抗体反应和
PCR
技术相结合、用于检测微量抗原的新技术。
IM-PCR
体系主要由
2
步反应组成，即抗原抗体的免疫反
应和常规的
PCR
反应。该技术既保留了抗原抗体
反应的特异性，又应用了
PCR
技术的高度灵敏性。
IM-PCR
具有高度特异性、快速检测、易于操作、
成本低廉等优点。夏俊芳等
[4]
应用免疫捕获
PCR
方法特异性的检测了
2
株金黄色葡萄球菌，且在
对
5
种食品模拟带菌检测时发现，该方法无需培
养，检测的灵敏度可达到
2.35
×
10
3
CFU·m L
1
，是
常规
PCR
检测灵敏度的
100
倍。然而，基于免疫
学技术的微生物鉴定及分型的局限性是有限的抗
原不能够代表微生物的整个基因组，在预测反应
分型方面有较大的局限性。免疫捕获
PCR
技术虽
然有一定程度的应用，但该方法尚处于研究阶段，
缺乏配套的试剂盒及成熟的方法，其应用受到一
定程度的限制。

1.3   
荧光定量
PCR
PCR
技术在理论上是指数方式增长的扩增曲
线，但是由于引物、模版、酶等因素的限制，实
时操作中通常表现为
S
型曲线。因此，常规的
PCR
很难根据
PCR
的扩增终产物计算起始模板的拷贝
数，即无法对初始模版进行定量分析。而荧光定
量
PCR
技术
(real-time  quantitative  PCR
，
RT-PCR)
在反应体系中加入荧光基团，通过荧光信号的积
累对整个
PCR
全过程进行实时监测，通过标准曲
线可对未知模板起始浓度进行定量。高正琴等
[5]
建立了特异性检查支原体的
Taq Man
探针实时荧
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·
1415
·

的方法。基因芯片技术为
1998
年自然科学领域的
十大进展之一，已经被广泛应用于临床诊断、药
物筛选、寻找新的基因、微生物检测等领域。基
因芯片具有高度的并行性、多样性、自动化和微
型化，可同时在一张芯片上进行多种微生物的快
速检测。基因芯片技术特异性强、灵敏性高，并
且可以减少化学试剂的使用量，是一种环境友好
性的技术。陈昱等
[16]
选取了志贺氏菌
ipa H
基因、
沙门氏菌
stn
基因和大肠杆菌
O157
的
slt
基因设计
探针，检测了
7
种
26
株细菌，仅
3
种食源性致病
菌得到阳性结果，表现出该方法的高特异性。同
时作者还发现，致病菌纯培养物和基因组
DNA
的
检测灵敏度为
8  pg
，即基因芯片技术比其他结束
具有更高的灵敏度。聂志强等
[17]
比较了基因芯片、
荧光定量
PCR
和宏观基因组学等
3
种分子生物学
技术在传统发酵食品发酵过程中微生物多样性和
功能的研究应用，发现基因芯片技术具有高通量、
集约化的优点，且通常与宏转录组技术结合进行
微生物群落与功能的研究。除了避免交叉污染外，
基因芯片可以通过回收利用降低研究和检测的成
本。黄国亮等
[18]
研究发现，
  
通过合理的探针设计
与杂交清洗条件，大肠杆菌和黄单胞菌基因芯片在
5
次重复使用后仍然有很高的荧光信号。因此，在
适当的条件下，基因芯片是可以多次重复利用的。

基因芯片技术是一种高通量、大规模、快速、
准确、平行的检测微生物的技术，但是尚未大量
转化为商品化产品使用。基因芯片技术需要的仪
器如寡核苷酸合成仪、扫面仪等价格昂贵，且对
基因芯片检测的结果判定上目前没有统一的标
准、样品制备难度大限制了其广泛的应用。随着
技术的不断发展和研究的深入，微生物基因库的
不断丰富，生物芯片技术在食品药品微生物检测
领域将得到更普遍的应用。

5   
生物传感器技术

生物传感器是将传感技术与分子生物诊断技
术相结合而形成的一门新技术。生物传感器对生
物物质敏感、并将其浓度转化为电信号进行检测。
生物传感器目前广泛应用于食品工业、医药行业、
发酵工业和环境监测等领域。生物传感器用生物
活性材料、生物衍生材料和生物仿生材料与物理
化学转换器进行有机结合的技术，是现代生物技
术领域一种新型的检测与监控手段。生物传感器
分为分子识别部分和转换部分，前者是生物传感
器特异性的基础，可以特异性的识别抗体、细菌、
细胞等。研制高质量生物传感器的另一个重要方
面是选择合适的换能器，主要依据是根据分子识
别功能物质制备的敏感元件所引起的化学变化或
物理变化。斯城燕等
[19]
基于表面等离子体共振原
理建立了生物传感器方法，并利用氢氧化钠溶液
对芯片再生，得到大肠杆菌
O157
∶
H7
的检测限为
3
×
10
5
CFU·m L
1
，且
RU
变化值与菌体浓度具有
较好的相关性
(r=0.99)
，是一种检测食源性致病菌
的有力手段。生物传感器除了可以对微生物进行
检测外，也可以基于全细胞微生物构建生物传感
器。钱俊等
[20]
基于对数生长后期和稳定期的大肠
杆菌微生物传感器具有良好的毒性分析功能，发
现了其在重金属及农药污染引起的急性生物毒性
方面和水体急性生物毒性在线监测具有较好的应
用前景。生物传感器在微生物检测领域虽然得到
了一定程度的应用，但是存在成本高、特异性低、
需专门人员进行检测，产业化生产程度低，因此
要不断加强生物传感器的技术革新，通过开发多
致病菌识别和高灵敏度的探针，在检测的灵敏度、
特异性方面不断提高，促进生物传感器技术在食
品药品微生物检测领域的应用。

6   
随机引物扩增多态性
(random  amplified  poly-
morphic DNA analysis, RAPD)
技术与微生物分型

近年来分子标记技术如
RFLP
、
AFLP
及
ARDRA
等迅速发展并得到广泛应用，但这些技术
均需要对基因组进行特异性扩增。但微生物物种
的繁多而使其应用受到一定的局限性。
RAPD
自上
世纪
90
年代建立以来，在临床检验及实验室微生
物分型方面发挥了重要的作用。
RAPD
的基本原理
是采用
8~12
个核苷酸长度的随机引物在低温条件
下进行退火，通过引物与基因组
DNA
的非特异位
点错配而复性，并通过
PCR
进行扩增。鉴于上述
原因，
RAPD
反应条件的优化是得到稳定、可靠的
微生物分型的关键。目前，
RAPD
技术已经广泛应
用于细菌、真菌及支原体等相关微生物分型。高
璐等
[21]
采用
RAPD
技术分析了淡水中分离的
59
株
副溶血弧菌和
107
株溶藻弧菌，发现前者有
18
个
基因型，后者有
21
个基因型。李西柱等
[22]
针对酒
酒球菌抗病性标记工作要求，以
SD-2a
为材料建
立并优化了酒酒球菌基因组
DNA
的提取方法及
RAPD-PCR
的反应体系，为进行酒酒球菌的抗性
形状分子标记奠定了基础。
RAPD
技术与其他技术
·
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·   
     Chin J Mod Appl Pharm, 2014 November, Vol.31 No.11                     中
国现代应用药学 2014 年 11 月第 31 卷第 11 期
光定量
PCR
方法，检测灵敏度达
9.2
拷贝，且与
空肠弯曲菌、肺炎克雷伯杆菌等
8
种细菌均无交
叉反应，为动物源性药品和生物制品中支原体的
快速检测提供了实用的方法。荧光定量
PCR
技术
也为检测食品中乳酸杆菌益生菌提供了简便、快
捷、灵敏的方法。
Herbel
等
[6]
研究表明，利用荧光
定量
PCR
技术可以特异性检测到酸奶中乳酸杆菌
的浓度为
10
5
CFU·m L
1
，能够完全满足商品中益
生菌浓度
(
通常为
10
6
~10
12
CFU·m L
1
)
的检测范围。

除了上述
PCR
方法外，热启动
-PCR
、递减
PCR
、巢式
PCR
、
COLD-PCR
等在其他领域有了
一定程度的应用，但在食品药品微生物检测领域
应用较少，不再叙述。

目前，
16s r RNA
或
ITS
基因
PCR
结合测序技
术已经在微生物属种层面鉴定和分型领域有了广
泛的应用，但是由于测序技术的误差及
16s r RNA
基因在微生物细胞内拷贝数的差异，该技术多用
于微生物的种属鉴定，在菌株层面上的分辨率具
有一定的局限性，应用较少。

2   
变性梯度凝胶电泳
(denaturing  gradient  gel
electrophoresis
，
DGGE)
DGGE
的基本原理是根据
DNA
在不同浓度的
变性剂中解链程度的不同而表现出不同的电泳迁
移率，进而将片段大小相同而碱基组成不同的片
段分离。结合
DNA
测序技术，
DGGE
电泳常用于
相似性聚类分析，其在研究食品、药品菌落组成
及动态变化、检测食源性致病菌等领域得到一定
程度的应用。
DGGE
通常与
PCR
和核酸测序结合
起来联合应用。王萌、王海等建立并优化了
PCR-
DGGE
技术体系
[7-8]
，分析了中药川芎内生真菌的
群落结构，并结合
DNA
测序技术，探究了不同产
区川芎内生真菌的差异性，并提出川芎内生真菌
种群的多样性和种群结构的相对固定性可能是影
响川芎地道性形成的重要因素。毕水莲等
[9]
利用鞭
毛蛋白基因
fla A
和
fla B
变性梯度凝胶电脉的方法
对食品中空肠弯曲菌和结肠弯曲菌污染进行了研
究，发现
Fla-DGGE
方法能实现对空肠弯曲菌和结
肠弯曲菌的快速检测和分析。李汉文等
[10]
利用
PCR-DGGE
结合传统的平板筛选法分析了海南特产
高辣度辣椒的微生物种群，筛选到了
Pseudomonas
stutzeri
等多株可培养菌株，并认为不同微生物对
黄帝椒的质量产生重要影响。
DGGE
在研究微生
物种群动态和多样性方面具有优势，但是该技术
无法实现对微生物代谢活性和数量方面的检测。
因 此 ，
DGGE
要 与 其 他 的 分 子 生 物 学 技 术 如
Real-time PCR
、基因文库分析相结合，更好发挥在
微生物种群结构及演变分析方面的作用。

3   MALDI-TOF
质谱技术

MALDI-TOF
质谱技术是近年出现的一种新
的微生物鉴定技术，可以实现对未知微生物的快
速检测、鉴定、分型、溯源及有毒无毒菌株的鉴
别等
[11-12]
。
MALDI-TOF
质谱通过对蛋白质的解离
分析来完成对微生物的鉴定及分型，其基本步骤
是将微生物样品与基质分别点在样品板上，溶剂
挥发后形成样品与基质的共结晶，然后通过激光
轰击，基质从激光中吸收能量使样品解吸，基质
与样品之间发生电荷转移使得样品分子电离，经
过飞行时间检测器，采集数据并获得图谱，从而
通过软件分析得到鉴定结果。
MALDI-TOF
质谱细
菌全细胞指纹图谱分析是根据蛋白质组表达进行
分析比较，考虑到蛋白质是表型的直接决定者，
该技术比从核酸水平进行微生物鉴定更为准确和
直接。陈秀金等
[13]
对沙门氏菌标准菌株用
MALDI-
TOF
质谱进行蛋白质指纹图谱分析，建立了沙门
氏菌的最佳培养基、最佳培养时间及样品处理的
标准方法，并发现沙门氏菌在哥伦比亚琼脂培养
基上
24  h
内得到了准确的结果，为食品药品沙门
菌污染的检测提供了参考。
Jadhav
等
[14]
利用
MALDI-TOF
质谱技术、通过选择性富集肉汤并检
测了李斯特菌，发现该方法可以检测极低水平的
李斯特菌。与传统的检测方法相比，该检测方法
的检测时间显著缩短、费用明显降低。
Tsilia
等
[15]
利用
MALDI-TOF
质谱技术检测了蜡样芽孢杆菌
(Bacillus  cereus)
致病菌种产生的肠毒素
Cyt K1(2
310.2 Da)
和
NHE(1 192.5 Da)
，并且发现在检测
Nhe A
方面
MALDI-TOF
质谱技术检测比免疫学试
剂盒
TECRA
效果更佳。
Tsilia
等也提出
MALDI-
TOF
质谱可以应用于评估食源性疾病暴发时是否
有蜡样芽孢杆菌的参与。另外，
MALDI-TOF
质谱
技术对多肽、蛋白质、低聚核苷酸和低聚糖等生
化新药及基因工程药物的相关研究和分析也具有
重要的应用前景。

4   
基因芯片技术

基因芯片又称生物芯片、
DNA
芯片，其基本
原理是核酸通过与已知序列的、在基片表面固定
的标记过的核酸探针杂交，然后进行核苷酸测序·
1412
·   
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国现代应用药学 2014 年 11 月第 31 卷第 11 期
·综
   
述·


微生物快速鉴定、分型技术在食药源性微生物检测中的应用




张国林
1
，景荣先
2
(1.苏州市食品药品检验所，江苏  苏州  215104；2.苏州市立医院本部药学部，江苏  苏州  215002)


摘要：
食品、药品微生物检测是保证食品、药品质量、维护人类健康的重要环节。传统的微生物检测、鉴定方法存在周
期长、主观性强等缺点，并且对一些生长缓慢或者新型微生物难以进行有效检测。现代微生物快速鉴定分型技术的发展
为食品、药品微生物检测提供了新的思路和方法。现代分子生物学技术和常规生化鉴定在微生物准确鉴定的属种水平上
有所差异，要将不同鉴定、分型技术相结合应用。本文综述食药微生物鉴定、分型技术的传统方法和现代分子生物学方
法进展及其在食品、药品微生物检测领域中的应用，为发展新型的微生物检测、分型方法提供借鉴和参考。

关键词：
微生物鉴定、分型；
PCR
；变性梯度凝胶电泳；基因芯片；生物传感器；标准检测方法

中图分类号：R927.1        文献标志码：A        文章编号：1007-7693(2014)11-1412-06
DOI: 10.13748/j.cnki.issn1007-7693.2014.11.029

Application  of  Microorganism  Identification  and  Genotyping  Techniques  in  Microbial  Contamination
Detection in Food and Drug Quality Control

ZHANG Guolin
1
, JING Rongxian
2
(1.Suzhou Institute for Food and Drug Control, Suzhou 215104, China; 2. Department of
Pharmacy, Suzhou Municipal Hospital, Suzhou 215002, China)


ABSTRACT: The microorganism detection, identification and genotyping are the most important aspects for the quality control
in  food  and  drug  fields.  However,  the  traditional  microbial  detection  methods  need  relative  long  period  and  the  result  may  be
influenced greatly by subjective judgment of the researchers to some extent. And traditional methods have disadvantages in the
discovering  of  new  microorganisms  or  microorganisms  that  grow  slowly.  The  development  of  modern  identification  and
genotyping  techniques  provide  new  directions  for  the  detection  of  microorganisms  in  food  and  drug  field.  In  this  review,  the
application  of  traditional  and  modern  microorganism  identification  and  genotyping  techniques  in  the  field  of  drug  and  food
quality  control  is  discussed.  At  the  same  time,  it  is  aimed  to  propose  new  ideas  in  order  to  provide  reference  and  technical
guarantees for the development of new method for microorganism detection besides the aforementioned areas.
KEY WORDS: microbial contamination detection; PCR; DGGE; gene chip; biosensor; standard detection method

                              
基金项目：苏州市科技发展计划(应用基础研究-医疗卫生)项目(SYS201425)
作者简介：张国林，男，博士，主管药师     Tel: 18262183668     E-mail: zhangguolin2006@163.com
食品、药品无菌和微生物限度检查是控制产
品质量、维护人类健康的重要措施。全世界每年
有数以亿计的食源性疾病患者，其中
70%
以上是
由食用被微生物污染的食品或饮水引起的。药品，
尤其是血浆、糖浆、滴眼液、氨基酸等药品的成
分和生化特性非常适宜微生物的生长、繁殖，容
易被微生物污染。药品受到微生物污染会影响药
品质量、诱发患者发生药源性疾病，严重影响患
者的健康，甚至会危及生命。国内外已有多起因
药品被微生物污染造成伤害的报道，如瑞典甲状
腺片的沙门氏菌污染、我国的“欣弗事件”、“齐
二药事件”等。目前对食品和药品中微生物检查
的标准方法主要采用传统的形态学观察和生化反
应，这些方法虽然经典，但均有赖于微生物的分
离、纯化、生化实验和血清学鉴定，操作步骤较
为繁琐，亦存在周期较长、灵敏度较低、主观性
强等局限性。另外，传统的微生物检测、鉴定和
分型方法对于一些生长缓慢或者新型微生物无法
进行有效检测，针对环境微生物种类的复杂性和
变异的普遍性具有较大的局限性。

微生物的现代分子生物学鉴定、分型技术的
发展为食品、药品微生物的检测提供了新的思路
与 方 法 。 如 聚 合 酶 链 式 反 应
(ploymerase  chain
reaction
，
PCR)
技术以指数方式扩增待检微生物的
DNA
，具有准确度高、灵敏度强等优点，实现了
从核酸水平上对微生物的检测。同时，通用引物
·
1416
·   
     Chin J Mod Appl Pharm, 2014 November, Vol.31 No.11                     
中国现代应用药学
2014
年
11
月第
31
卷第
11
期

相结合，可以加速重要基因的获取进程，与染色
体步移技术结合可完成相关基因的定位与克隆分
离。随着
RAPD
技术的更加成熟，其在流行病学
及菌株鉴别上将发挥更重要的作用。

7   
基于抗原抗体反应的免疫技术与微生物鉴定
分型

分子生物学技术的成熟促使融合抗体偶联物
的制备成为可能。酶联免疫吸附测定是将抗原、
抗体特异性反应和酶的高效催化结合的一项技
术，其原理是将酶标记的抗体结合到固相载体表
面，既保留抗体的免疫活性，又保留酶活性。待
检测样品与固相载体表面抗体反应后结合，未结
合的残留部分被洗脱。然后加入与抗体结合酶的
反应底物进行显色，并分析抗原种类及丰度。史
艳宇等
[23]
将
PCR
技术与
ELISA
技术相结合，建立
并优化了食品中空肠弯曲菌的
PCR-ELISA
，且发
现建立的方法特异性强、灵敏度高，可用于快速
检测食品中污染的空肠弯曲菌。勇倩倩
[24]
以
E.coli
O157
∶
H7
免疫动物得到单克隆抗体并建立可对
其具有较好特异性的
ELISA
检测方法，能够检测
出绿茶中
1 CFU·m L

1
的
E.coli  O157
∶
H7
抗原，
极大的提高了检测的灵敏度和高通量要求。与常
规的检测方法相比，
ELISA
检测具有灵敏度高、
时间短和操作简便的优点。同时，该方法基于抗
原决定簇与抗体反应，受外部干扰影响较小。但
是，
ELISA
方法也存在一定的缺陷：主要是免疫
反应特异性强，对试剂的要求较高；对结构类似
抗原存在一定程度的交叉反应，应优先选择单克
隆抗体；
ELISA
方法无法有效检测分子量较小的
化合物或体积较小的微生物。另外，基于免疫技
术的微生物检测方法还包括测流免疫层析技术、
时间分辨荧光免疫分析法、免疫磁性分离
-
电化学
发光技术等。

8   
讨论

微生物污染是影响食品药品安全的重要因
素。探索新的、准确、灵敏的微生物检测、鉴定
及分型技术对保证食品、药品质量十分必要。现
代分子生物学技术的发展为微生物检测提供了新
的思路和方法，
PCR
或
MALDI-TOF-MS
可以实现
从核酸或蛋白质水平上直接对微生物进行分析，
在效率、准确性和灵敏度方面较传统方法都有了
很大程度的提高。同时，
RT-PCR
方法也可以对待
检测的微生物定性的基础上实现定量。同时，传
统方法作为经典的微生物检测、鉴定方法，具有
不可替代的作用。一般来讲，不同的鉴定方法在
准确鉴定层面上有所差异，如
16s r RNA
能准确鉴
定到属种，但对菌种、菌种层面上分辨率具有局
限性；
API
条收录
1  500
余种菌种特征，在属水平
上准确性更高，
VITEK
收录细菌特征较少，但包含
的生化反应达到
60
多种，在种的鉴定上更有优势。

分子生物学方法对微生物检测目前主要处于
实验室研究或检测、分型阶段，仅作为标准检测
方法的参考，在生产实践中的应用尚待加强。
  
因
此，在以后的工作中要加强基于现代微生物检测、
鉴定及分型手段的生产实际应用，并在结合传统
的微生物鉴定方法的基础上，建立标准化的食品
药品微生物检测方法。同时，现代分子生物学技
术为微生物污染的溯源也提供了一定的技术支
撑，尤其是对无菌药品阳性检出菌及食药中致病
菌、控制菌的溯源具有十分重要的意义。目前，
笔者所在单位已经对此项工作进行了探索性研
究，并取得了一定的结果。

因此，采用现代分子生物学技术结合传统方
法对微生物进行鉴定、分型，并对检出的微生物
污染进行溯源，提供准确、客观的检验结论，可
以为相关部门采取有力的措施进行预警提供技术
支持，为食品、药品质量控制、准确检测和安全
生产保驾护航。

阿炳1987

楼主能不能好好编辑一下，这是从手机上copy下来的吧…

syhorchid

啥玩意儿

13808089579

楼主能不能好好编辑一下，这是从手机上copy下来的吧…