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本帖最后由 蒲公英 于 2017-5-5 07:50 编辑
【导读】本文作者：梅特勒－托利多，苗述，来自：蒲公英小五班微信群分享
今天给大家分享并且交流一下现在国际上一个应用在水系统上的新技术----在线微生物检测。希望大家感兴趣。我们将会从这个几方面对这个新兴的技术进行介绍，包括新技术的好处、特点、应用在什么地方，以及大家最关心的法规部门的态度和如果使用的话，如何去验证。
首先，我们需要解决一个问题，既然目前已经有现成的并且是法规支持的微生物检测技术，为什么还要用新的方式，它有什么不同？
其实，对于传统的微生物检验，相信大家都非常熟悉了。即通过培养基，在适当的条件下，如温度、时间对微生物进行培养，最终得到可见菌落进行计数和分析。这种方式已经有相当的历史了，早在1887年由Koch博士和Petri博士发明出来，并且沿用至今。是一个在各个微生物相关领域被大家所熟知的，非常经典的方法。对于这种方法，我们一般在一个特定的温度下对微生物进行培养，通过特定的培养基和培养时间，最终得到可见菌落（CFU），以此来对微生物水平进行考量。
因为这种方法早在19世纪就开始使用，随着科学技术的发展，尤其是目前自动化生产和控制技术的飞速发展，制造的产量和效率都得到了巨大的提高。这种传统的方式也正在经受来自各个方面不同的考验，比如说它的准确度、适用性、成本等。更多的人和组织也正在寻求更加贴合目前生产条件的新的检测方法。
OWBA，这个由默克、诺华、百特、罗氏、赛诺菲、辉瑞等多个知名制药企业组成的机构正在对线微生物检测方法进行研究和推广。并且率先让实时微生物检测方式实践于自己的企业。他们通过多方面的调研，发现微生物检测，尤其是水系统微生物的控制，检测点数量之多、频次之高以及耗材之多，需要耗费相当的人力、物力和财力，成本相对较高。更重要的是，通过离线培养的检测，得到的结果是滞后的，一经发现问题，不仅要启动调查机制，而且需要对之前的产品进行处理。否则，如果等到所有结果都通过后，再放行产品，但是这样往往又耽误了必要的上市时间，造成商务上的损失。阳性结果也是另外一个问题，它的出现同样会让企业花费更多的精力去进行调查。而通过调查，这种传统的离线微生物培养法，其阳性结果中，近80%的比例都是假阳性，来源于我们的日常操作以及环境的影响。
与此同时，FDA鉴于过程分析技术的创立和应该用（PAT），更多的在线设备被运用到我们的生产过程中以达到实时监控的目的，也在致力于在线微生物技术的推广。我们已经熟知的在线电导率和TOC，尤其是新纳入药典的TOC技术，就是由此发展而来的。
而对实验方法本身，也存在一些问题。我们来看一个例子，在相同浓度的菌液中（100cells/ml），通过培养以后，我们得到的CFU往往是不同的。下面选取了3个比较接近的结果，分别是41CFU、45CFU和50CFU。 
而对于一系列不同浓度，则表现出，随着浓度的提升，平板计数的结果和实际情况的差异将会进一步扩大。而在新技术可以较为准确且快速的检测出实际微生物的数量，而传统方法则存在一定的误差。
这是什么原因呢？就是因为传统的方法，采用的是菌落数（CFU）这一个概念，这个单位其实是一个估计值。因为能形成可见菌落的实际微生物的数量大相径庭，往往表面上看似好像是1个菌落，但是到底有多少个微生物？我们很难找到一个关联的关系。所以，我们用这种方法对实际情况进行说明，可以说是不准确的。这就好比我们看地图，CFU可能是我们看到的一个一个的城市，但是每个城市里面有多少人口，不知道。而新技术则检测出来的是人口的数量。
况且，还有一些微生物，根本是没有办法通过既定条件培养出来的。但是这些微生物却逃不过在线实时监测技术的眼睛。
当然，美国药典委（USP）也看到这里面的问题，所以我们目前开始着手逐步推动新的检测方法。而且，新方法的新的数量级体系，将会远远高于目前我们的传统观念。这是一个全新的标准。在USP意识到这个问题之后，他们也提出了相应的对策，或者是过渡措施，即允许采用替代方法进行微生物的检测，那么我们现在给大家介绍的这种在线检测方式，就是其一。并且方法的原理也是USP中列举的三大检测原理之一。
那么，在线微生物检测的好处在哪里？相比于传统的离线培养方法，它结果可靠并且准确，是实测值，不是估计值；在线测量降低了人为假阳性的概率；在线检测时间短；成本低，一次性投入，基本无后续耗材。新技术的特点在于，是一个新的，更为准确的单位体系。自动化程度高，操作简单，完全可以通过计算机系统进行控制；检测范围广，可以在纯化水和注射用水系统上使用。支持多种数据传输方式，符合21CFR Part11。
至于为什么在线微生物检测技术可以抛弃传统方法的限制，能检测到几乎所有的微生物？这就依赖于它涉及的两大检测原理，都有非常成熟的应用：荧光检测法和粒子散射检测。我们运用激光光束对样品进行照射，从而样品中被激发出的荧光和散射光束，收集之后，通过内部软件进行判别。
首先给大家介绍散射原理，通过405nm的激光光束，被照射的样品中如果存在颗粒（惰性粒子或微生物），在照射原光束会发生散射，不同的散射角度对应不同的粒径大小。这个技术在半导体以及微电子领域都有成熟的应用，我们都知道，这两个行业对粒子的数量和尺寸都是有这非常严格的要求。
其次是荧光检测。因为活性微生物或者是在微生物的日常生化反应中都存在代谢产物，如酪氨酸、色氨酸、NADH以及核黄素，且这些物质一般同时存在。而405nm可以激发NADH和核黄素在更高的波段产生荧光，通过检测特定波段的荧光，来判断是否为活的微生物。综合上述两种结果，即同时符合散射标记的粒子大小又符合有相应波长的荧光反应，当这两个结果都存在的条件下，可以判定粒子是微生物，否则即为惰性粒子。
所以，我们可以看一下，这两个通道产生的信号反馈，叠加之后，在同一时间，都出现信号相应的时候，我们判断其为微生物。 
在了解了所有的背景知识之后，我们应该把在线微生物设备安装在什么地方呢？其实安装方法和安装位置可以参考在线TOC。一般的公认的监测点至少应该是使用点之后的总回水管上。该点的微生物水平可以代表整个环路的最差条件。或者根据用户的自身需要，自己设置监控点。除此之外，还可以把设备安装在移动平台上，对每个用水点进行在线监控。
接下来我们来看一下法规方面的要求。
在开始我们也提到了，诸如FDA, USP等机构，均在法规或者指导文件中提及在线微生物检测方法。说明这种方法相对与传统方法而言，是切实可行的，只不过目前还没有明确的记入相关条款，要使用它们，我们还需要前期进行一些工作。
为什么没有马上进行改革？其中一个非常重要的原因在于微生物的根本特性。以USP为例，我们可以看到，诸如像电导率，pH等依靠化学分析的方法，都归类在实验章节。而实验章节的很多检测项目，都是可以用SOP确定下来的，是一种非常准确的定量的方式，有明确的检测法和检验标准。而微生物相关的检测手段只是记录在通则中，正是因为对于微生物没有人能明确规定方法对其进行检测，它具有不确定性和多样性。因此，如果我们要用新的方式去对微生物进行检测的话，前期需要做适当的验证。
欧盟（EP 5.1.6）和美国药典（USP1223），都有相应的通则指导生产企业进行验证，并且明确只要通过验证，替代传统方式的微生物检测方式是可以被接受的。这也正是我们的现状。而我们国家药典通则9201，亦如是说。
最后，给大家分享一些我们目前正在进行的关于验证方法的一些研究。通过对各国药典相应章节的解读，我们推荐了2种对可替代微生物检测方式的验证手段：在线和离线。方法1是在线方式，应该也是生产企业比较乐于接受的方式，因为这种方式直接代表了我们日常的生产条件，并且我们不用引入外来的菌种进行测试。简单的说，我们只需要选择好检测位点，做好前期的设备确认工作，为验证工作制定专门的SOP，包括我们的取样频率和数量。最后对在在线方式和离线方式两种方法做相应的分析和对比即可。方法2是离线方法，多适用于实验室。即用配制样品的方式，人为选取若干菌种和浓度梯度进行检测，最后对比结果。具体的菌种选测和浓度梯度，以及同一浓度的样品数目均可以参考药典上相应的方法。两种方式各有利弊。 
总的来说，我们从对制药用水几大参数的检测方法的发展可以看出，在初期，我们也是用比较原始的方法去检测诸如TOC等参数，之后我们发明了仪器测量法，而后我们又把离线的仪器测量法升级为目前的在线监控，最终写入法规作为我们目前的通用标准。对于微生物也是一样的，只不过因为复杂程度比较高，导致起步比较晚，但是请相信，它必定会沿袭这个方向，最终成为顺应时代发展的检测手段。
新的技术需要我们的共同努力去实践从而变成现实，以此来提高我们的水平和工作效率，确保制药过程的稳定和高效以及安全。
最后，借此机会祝愿广大的制药同仁工作顺利，家庭美满。
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