无菌检查那些事

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前言

无菌检查法（Sterility tests），顾名思义就是检查是否无菌，至于检查什么，凡是药典要求无菌的药品、医疗器具、原料、辅料等均需要经过此项检查，因此它也成为制药行业绕不过去的一个话题。

虽然中国药典、美国药典等，都对无菌检查法进行了明确的规定，但不同国家中具体实施却不尽相同，因此对于那些中美双报或者多个国家申报的公司，明确各国药典中差异尤为重要。大家更为关注的一个问题是，能不能开发出同时满足多国申报的无菌检测法，或者该怎样设计实验能够更具性价比地满足多国申报的要求？下文就此问题，谈谈个人见解。
一 认识无菌检查法除去培养基制备、储存和稀释液、冲洗液配制等准备工作，无菌检查法实际包含3个部分的实验，分别为：培养基适用性检查、方法适用性试验和供试品的无菌检查。培养基适用性检查：主要目的有两个，一是确认使用的培养基本身是无菌的，即无菌性检查，通过在适宜温度下放置培养基观察判定；二是确认使用的培养基细菌或真菌是可以舒舒服服生长并且在规定时间内可以被观察到，即灵敏性检查，通过接种特定菌种，观察菌生长状态判断。进行了以上实验，就可以判断检测不到细菌真菌，不是培养基自身造成的。方法适用性试验：主要目的是判断采用的方法，薄膜过滤法或者直接接种法，是否适用于你要检测的这种产品。尤其是一些产品，本身就含有抑菌成分，这种情况下难道在整个检验期内结果呈现阴性，就是真的无菌了吗？答案是不一定的，因此我们需要排除检验过程中操作或者产品本身的抑菌性。当一个新产品进行无菌试验或者实验条件改变时，需要进行验证试验，可与供试品无菌检查同步进行。供试品的无菌检查：这就是实打实的对于产品的无菌检测，从检测数量、检验量、阴/阳性对照、接种要求、培养观察和结果判读全都进行了细致规定。谈谈检测数量和检验量，检测数量是一批次一定数量的产品中需要抽检的数量，检验量是每瓶/支中要取多少体积的供试品用于检测。对于检测数量和检测量的规定更好更全面地评估了整批样品的无菌性。▲ 表1-无菌检查法药典包含项目或规定

项目	步骤		CHP2020	USP2021
检测环境	无菌		√	√
稀释液/冲洗液制备	配方		√	√
	灭菌		√	√
培养基制备	配方/商用培养基		√	√
	灭菌		√	×
	保存		√	√
	品类		√	√
培养基适用性	无菌检查		√	√
	灵敏度检查/促生长实验	菌种	√	√
		菌液制备	√	×
		接种	√	√
		结果判定	√	√
方法适用性	菌液制备		√	×
	接种	薄膜过滤	√	√
		直接接种	√	√
	结果判定		√	√
供试品无菌检查	检验数量		√	√
	检验量		√	√
	阴性对照		√	√
	阳性对照		√	×
	接种	薄膜过滤	√	√
		直接接种	√	√
	培养观察		√	√
	结果判定		√	√

二 各国药典中无菌检查法章节▲ 表2-无菌检查法各国药典章节

国家	药典章节	标题
中国	Ch.P.<1101>	无菌检查法
美国	USP<71>	Sterility test
欧洲	EP 2.6.1	Sterility
日本	JP 4.06	Sterility Test
英国	BP APPENDIX XVI	Test for Sterility

三 各国药典比较分析关于无菌检查法，美国、日本、欧洲药典等基本实现药典协调，因此本文着重以中美之间的差异为切入点进行分析：1、菌种差异

用于无菌检测的“官方菌”，虽然各国采用的种类大致相同，但菌种往往带有独特的ID编号。拿中国来说，“中国医学细菌保藏管理中心（CMCC）”为主流机构，而欧美国家则普遍认可“美国标准菌种保藏中心（ATCC）”、“法国巴斯德研究所菌种保藏中心（CIP）”、“英国菌种保藏中心（NCTC）”、“日本菌种保藏中心（NBRC）”和“英国食品工业与海洋细菌菌种保藏中心（NCIMB）”，下列出不同药典要求的菌株编号：▲ 表3-无菌检查法药典包含项目或规定

名称	CHP2020<1101>	USP<71>
金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)	CMCC(B) 26 003	ATCC 6538, CIP 4.83, NCTC 10788, NCIMB9518, NBRC 13276
铜绿假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa)	CMCC(B) 10 104	ATCC 9027, NCIMB8626, CIP 82.118, NBRC 13275
枯草芽抱杆菌 (Bacillus subtilis）	CMCC(B)63 501	ATCC 6633, CIP 52.62 NCIMB 8054, NBRC3134
生孢梭菌 (Clostridum sporogenes)	CMCC(B)64 941	ATCC 19404, CIP 79.3,NCTC 532 or ATCC11437, NBRC 14293
白色念珠菌 (Candida albicans)	CMCC(F) 98 001	ATCC 10231, CIP 48.72,NCPF 3179, NBRC 1594
黑曲霉 (Aspergillus brasiliensis / Aspergillus niger)	CMCC(F) 98 003	ATCC 16404, CIP 1431.83 IMI 149007, NBRC 9455
大肠埃希菌 (Eschericichia coli)	CMCC(B) 44 102	__

对于不同来源的菌株，国家药典委在2018年ICH Q4药典相关检测方法专题研讨会给出的协调建议是“基本一致，可以协调，不同来源菌株一致性需进行验证”。中国药典<9203>药品微生物实验室质量管理原则中也谈到“标准菌株应来自认可的国内或国外菌种保藏机构”，<1101>中却并没有提及可以使用等效菌株代替。而美国药典<71>里也并未提及同<61>“equivalent strains”。如何判断不同的编号和机构的同一种菌具有等效性呢？如何开展相关的验证实验？这一点其实没有明确的定论。

https://www.usp.org/frequently-asked-questions/microbial-examination-nonsterile-products-microbial-enumeration-tests2、稀释液/冲洗液

通过对中美药典的对比，不难发现中美的稀释液和冲洗液存在差异。稀释液或冲洗液用于薄膜过滤法，美国药典列出了3种不同的稀释液，分别为溶液A，溶液D，溶液K。溶液A和中国药典的0. 1% 无菌蛋白胨水溶液配方是一致的。而溶液D为溶液A额外添加表面活性剂，实际上符合中国药典“如有需要，可在上述溶液中添加表面活性剂或中和剂”。另外，中国药典并没有锁死稀释液/冲洗液类型，那么如果美国溶液K经验证后，不对无菌检查法造成影响，是否也能得到中国药典的认可？溶液K主要可用于油剂和油性溶剂的稀释，而中国药典中对于非水溶性供试品的规定为“ 取规定量，直接过滤；或混合溶于适量含Tween 80或其他适宜乳化剂的稀释液中”。虽然不少文章或研究对用于非水溶性供试品检测的稀释液进行改进，如使用磷酸盐溶液、摸索Tween 80浓度梯度等，但笔者认为，如现有稀释液可满足方法适用性，则应该使用药典上明确规定的稀释液。

稀释液/冲洗液（Diluting and Rinsing Fluids）
中国		美国
0. 1% 无菌蛋白胨水溶液	取蛋白胨 1.0 g, 加水1000 mL , 微温溶解，必要时滤过使澄清，调节 pH 值至7. 1 ± 0.2, 分装，灭菌。	溶液A (Fluid A)	将1g蛋白胨溶解于1L水中，必要时过滤或离心澄清，并调节到pH值为7.1 ± 0.2。分装到容器中，并使用有效的方法消毒。 用于青霉素和头孢菌素稀释剂，可添加β-内酰胺酶
pH7. 0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液	磷酸二氢钾3.56g, 无水磷酸氢二钠 5. 77g, 氯化钠4.30 g, 蛋白胨1. 00g, 加水1000mL， 微温溶解，必要时滤过使澄清，分装，灭菌。	——	——
其他经验证的适宜溶液	根据供试品的特性，可选用其他经验证的适宜溶液作为稀释液或冲洗液（如0.9 %无菌氯化钠溶液）。	溶液K (Fluid K)	取蛋白胨5.0 g、3.0 g牛肉浸粉（beef extract）、10.0 g吐温80 溶于水，定溶到1 L。调节pH值，灭菌后pH值为6.9±0.2。分装到容器中，并使用经过验证工艺灭菌 用于青霉素和头孢菌素稀释剂，可添加β-内酰胺酶
备注：	如需要，可在上述液体中加入表面活性剂或中和剂等	溶液D (Fluid D)	在每升溶液A中加入1 mL吐温80，调整pH值为7.1 ± 0.2，分配到容器中，并使用有效的工艺消毒。此溶液用于含有卵磷脂或油脂的产品或无菌设备。 用于青霉素和头孢菌素稀释剂，可添加β-内酰胺酶

3、培养基差异

而主要培养基，硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨培养基，虽然中美药典要求大致相似，但仍需要注意细节问题。

培养基 Medium
中国		美国
硫乙醇酸盐流体培养基		Fluid Thioglycollate Medium
胰酪胨	15.0g	Pancreatic Digest of Cascin	15.0g
酵母浸出粉	5.0g	Yeast Extract(water-soluble)	5.0g
葡萄糖/无水葡萄糖	5.5g/5.0g	Dextrose Monohydrate/Anhydrous	5.5/5.0g
L-胱氨酸	0.5g	L-cystine	0.5g
硫乙醇酸钠/硫乙醇酸	0.5g/0.3mL	Sodium Thioglycollate or Thioglycolic Acid	0.5g/0.3mL
氯化钠	2.5g	Sodium Chloride	2.5g
新配制的刃天青水溶液(0.1%)	1.0mL	Resazurin Sodium Solution (1:1000) freshly prepared	1.0mL
琼脂	0.75g	Agar	0.75g
水	1000mL	Purified Water	1000mL
取除葡萄糖和刃天青溶液外的各成分混合，微温溶解，调pH为弱碱性，煮沸，滤清，加入葡萄糖和刃天青溶液，摇匀，调pH，使灭菌后在25℃的pH为7.1 ± 0.2。分装至适宜容器。装量不超过容器1/2高度，接种前，氧化物高度不超培养基1/3深度。		将L-胱氨酸、琼脂、氯化钠、葡萄糖、酵母提取物和胰酪胨与纯化水混合，加热至溶解。将硫乙醇酸钠或硫乙醇酸溶解在溶液中，必要时加入1 N 氢氧化钠，使灭菌后溶液的pH值为7.1±0.2。如果需要过滤，再次加热溶液，不要煮沸，趁热通过湿润的滤纸过滤。加入刃天青溶液，混合，并将培养基置于合适的容器中。 用于青霉素和头孢菌素的培养基，可添加β-内酰胺酶灭活抗生素。
分析：葡萄糖、刃天青溶液、硫乙醇酸钠或硫乙醇酸添加顺序不一样。
胰酪大豆胨培养基		Soybean - Casein Digest Medium
胰酪胨	17.0g	Pancreatic Digest of Casein	17.0g
大豆木瓜蛋白酶水解物	3.0g	Papaic Digest of Soybean Meal	3.0g
葡萄糖/无水葡萄糖	2.5g/2.3g	Dextrose Monohydrate/Anhydrous	2.5g/2.3g
氯化钠	5.0 g	Sodium Chloride	5.0g
磷酸氢二钾	2.5g	Dibasic Potassium Phosphate	2.5g
水	1000mL	Purified Water	1000mL
取除葡萄糖外的各组分混合，微温溶解，滤过，调节pH使灭菌后在25℃的pH值为7.3±0.2，加入葡萄糖，分装，灭菌。		将固体溶解在纯净水中，稍微加热形成溶液。将溶液冷却至室温，用1 N氢氧化钠调节pH，使灭菌后pH为7.3±0.2。过滤，如果需要澄清，分配到适当的容器，并使用验证程序灭菌 用于青霉素和头孢菌素的培养基，可添加 β-内酰胺酶灭活抗生素。
分析：葡萄糖添加顺序不一样。

4、汇总对比分析

下表汇总对比了无菌检查法在中美药典中的差异，其中红色标记为需要重点关注的地方：

项目	步骤		CHP<1101>	USP<71>
检测环境	无菌		达到无菌条件	达到无菌条件
稀释液/冲洗液制备	配方		自配，配方包含0.1% 无菌蛋白胨水溶液、pH7. 0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液和其他溶液	自配，配方包含溶液A、K、D （其中A为0. 1% 无菌蛋白胨水溶液）
	灭菌		需要灭菌	需要灭菌
培养基制备	配方/商用培养基		自配/商用产品。配方顺序略有不同	自配/商用产品。配方顺序略有不同
	灭菌		验证合格的灭菌程序灭菌	验证合格的灭菌程序灭菌
	保存		2-26℃、避光、无菌密闭容器	2-26℃、无菌密闭容器
	品类		硫乙醇酸盐流体培养基； 胰酪大豆胨液体培养基； 中和或灭活用培养基； 0.5% 葡萄糖肉汤培养基； 胰酪大豆胨琼脂培养基； 沙氏葡萄糖液体培养基； 沙氏葡萄糖琼脂培养基； 马铃薯葡萄糖琼脂培养基 (PDA)	硫乙醇酸盐流体培养基； 大豆酪蛋白消化物培养基
培养基适用性	无菌检查		≥5支瓶/批，14天无菌	取部分培养基，14天无菌
	灵敏度检查/促生长实验	菌种	传代不超5次，菌种确认 金黄色葡萄球菌； 铜绿假单胞菌； 枯草芽孢杆菌； 生孢梭菌； 白色念珠菌； 黑曲霉	传代不超5次，菌种确认 金黄色葡萄球菌； 铜绿假单胞菌； 枯草芽孢杆菌； 生孢梭菌； 白色念珠菌； 黑曲霉
		菌种接种	①TSB-金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌（20~25℃）； ②FTM生孢梭菌 (30~35℃,18-24h)； ③沙氏葡萄糖液体/琼脂培养基-白色念珠菌（20~25℃,2-3d） ④沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基/马铃薯葡萄糖琼脂培养基-黑曲霉（20~25℃,5-7d）	需氧菌、厌氧菌、真菌促生长实验，20-25℃培养，TSB可代替FTM
		菌液制备	①金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌用0. 1% 无菌蛋白胨水溶液或pH7. 0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释； ②黑曲霉孢子用添加一定浓度tween80的稀释液洗脱制备；	无规定
		菌液保存	室温2h、2-8°C 24h；黑曲霉孢子2-8°C，验证保存时间	无规定
		接种	≤100cfu；2个重复；1个空白对照；细菌培养≤3d；真菌培养≤5d	≤100cfu；细菌培养≤3d；真菌培养≤5d；无空白对照
		结果判定	空白管无菌生长，加菌培养管生长良好	培养基微生物生长良好
方法适用性（可与供试品无菌检查同步进行）	菌种		金黄色葡萄球菌； 枯草芽抱杆菌； 生孢梭菌； 白色念珠菌； 黑曲霉； 大肠埃希菌	金黄色葡萄球菌； 铜绿假单胞菌； 枯草芽孢杆菌； 生孢梭菌； 白色念珠菌； 黑曲霉
	菌液制备		同灵敏性检查；大肠埃希菌制备同金黄色葡萄球菌	无规定
	接种	薄膜过滤	① 供试品最后一次薄膜过滤冲洗液添加≤100cfu试验菌，接种相应培养基 ② 每种菌1个对照，加入同量试验菌 ③ 培养时间≤5d	①最后一次薄膜过滤冲洗液添加≤100cfu测试菌株，接种相应培养基
		直接接种	① 供试品接入TSB和FTM培养基，每种3管； ② 接种≤100cfu到相应培养基，6种菌共6管，作为对照 ③ 培养时间≤5d	① 供试品接入TSB和FTM，可添加β-内酰胺酶 ② 接种≤100cfu菌株到相应培养基，设置促生长实验为阳性对照 ③ 培养时间≤5d
	结果判定		与对照管相比，供试品管生长良好，则供试品无抑菌作用	与促生长阳性管相比，供试品管生长良好，则供试品无抑菌作用
供试品无菌检查	检验数量		1.批出厂产品及生物制品原液和半成品： ①注射剂少于100检验10%或4个（选较多）；②数量100-500检验2%或20个； ③数量500检验2%或20个（选较少）； 2. 上市抽验样品： 液体制剂检验数量大于等于10个 注：每瓶装量必须满足接种2个培养基，否则数量翻倍	1.批出厂产品及生物制品原液和半成品： ①注射剂少于100检验10%或4个（选较多）；②数量100-500检验10%； ③数量500检验2%或20个（选较少）； 2.上市抽验样品： 液体制剂检验数量大于等于10个 注：每瓶装量必须满足接种2个培养基，否则数量翻倍
	检验量		1.生物制品原液及半成品：每只接入培养基最少量为半量； 2.液体制剂根据容量选择检验量	1.无特定生物制品规定； 2. 根据供试品种类和容量选择建言量
	阴性对照		相应稀释液	设置适当阴性对照
	阳性对照		1. 对照菌 ①无抑菌及抗G+的供试品为金黄色葡萄球菌为对照菌； ②抗G-供试品对照为大肠埃希菌； ③抗厌氧菌供试品对照为生孢梭菌 ④抗真菌供试品对照 白色念珠菌 2. 接种≤100cfu，培养时间≤5d	无需阳性对照
	接种	薄膜过滤	①冲洗次数≥3次；每次冲洗100mL，总冲洗量一般不超过500mL,最大不超过1000mL	①冲洗次数≥3次，不超过5次；每次冲洗100mL ② 膜滤器孔径≤0.45um
		直接接种	①生物制品   FTM:TSB=2:1 ② 供试品接种体积不大于培养体积10% ③ 装量要求FTM ≥15mL；TSB ≥10mL	供试品接种体积不大于培养体积10%，无生物制品要求，无装量要求
	培养观察		① 培养时间≥14d ② 接种生物制品FTM分成2等份，1份置 30-35°C 培养，1份置 20-25°C 培养； ③ 14天培养基若出现浑浊，接种不少于1mL原始培养物到新鲜培养基继续培养不少于4d	①培养时间≥14d ②接种生物制品FTM（可选硫乙醇酸盐代替培养基）置 30-35°C培养； ③14天培养基若出现浑浊，接种不少于1mL原始培养物到新鲜培养基继续培养不少于4d
	结果判定		阴性对照澄清，供试管均澄清，或虽显浑浊但经确证无菌生长，判供试品符合规定	阴性对照澄清，供试管均澄清，或虽显浑浊但经确证无菌生长，判供试品符合规定

四 小结本文介绍了无菌检查法，并对比分析了该方法在各国药典中的规定。出于一些考虑，中国药典的无菌检查法暂时没有和国际统一，这对于药品双报或多报的企业来说就有了更多的挑战，按不同的药典要求建立符合注册国的无菌检查法对于注册而言可能更加稳妥。在这里也提出一些展望，现行的无菌检查法周期过长，开发出合理靠谱的无菌快速检测技术意义非凡，期待那一天早日到来。药典协调之路道阻且长，药企应因地制宜做好充分准备。作者水平有限，文中内容难免疏漏，望广大同仁批评指正。

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(出处: 蒲公英 - 制药技术的传播者 GMP理论的实践者)

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