蛋白定量《六种方法》详细介绍，蛋白总量测定、DLS、NTA、纳米颗粒、纳米流式细胞

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背景介绍 外泌体（Exosome）是近年来生物医学科学中呈指数增长的细分领域，目前外泌体研究仍是生物研究中的热点话题。前面我们分享了外泌体的提取方法，那么通过提取后，我们如何知道提取了多少外泌体，提取得外泌体纯度是否符合要求。随着技术和仪器的不断进步，涌现出了许多外泌体定量的方法。今天，为大家整理了几种常见方法，我们一起看下去吧！ 方法对比 第一种测定蛋白总量，如BCA、Bradford检测等方法，这是最快速、简便的方法，通过检测不同样品间的蛋白总量比较外泌体含量，也就是我们经常在文献中看到的使用了多少μg/mg的外泌体。但是该类的检测方法无法区分外泌体蛋白和非外泌体蛋白，所以具体分析时需要保证样品中不可含有非外泌体的蛋白，或者不同样品的非外泌体蛋白含量需保持一致。此外Bradford试剂无法穿透外泌体膜，且不兼容浓度在0.125%以上的Triton-X100以及SDS，因此只能用于外泌体表面的蛋白定量。 第二种即是动态光散射技术（Dynamic light scattering, DLS）。DLS是广泛应用于脂质体表征的技术，由于外泌体与脂质体在形态上十分相似，因此也有人将DLS应用于外泌体的测量上。DLS利用光射到远小于其波长的小颗粒上时会产生瑞利散射现象，通过观察散射光的强度随时间的变化推算出溶液中颗粒的大小。在外泌体研究过程中，DLS测量灵敏度高，下限为10 nm，样品前处理简单，只需简单的过滤，测量速度快。但是这种技术是测量光强度的波动数据，所以大颗粒的光强波动信号会掩盖较小颗粒的光强波动信号，所以动态光散射不适合大小不一的复杂外泌体样本的测量。 另一种基于光学方法的测定技术—纳米颗粒跟踪分析技术（Nanoparticle Tracking Analysis，NTA），利用激光散射显微成像，记录纳米粒子在溶液中的布朗运动轨迹，并通过Stokes-Einstein方程推算粒子大小和分布。该方法弥补了DLS的短板，具备更高的精准性，目前成为外泌体最主流的表征定量手段。然而，NTA是对溶液中颗粒进行整体的测量，无法分辨是否是外泌体还是其他非外泌体颗粒。 NTA激光光路图，激光光束从较小角度入射进入样品溶液，照亮溶液中的颗粒。配备相机的光学显微镜，被放置在特定的位置上，收集视野中被照亮的纳米颗粒发射出的光散射信号 第四种方法是基于电阻感应脉冲（RPS）技术的纳米颗粒分析技术，该方法原理是在电解质液体中的芯片孔两侧装上电极，在有电流通过的情况下，小孔周围产生局部的电感应区，随着每个颗粒通过小孔，颗粒会置换出对等体积的导电液体，改变该电感应区的电阻，形成电位脉冲，通过仪器的准确测量分析得到颗粒的多维信息。该方法相较于传统光学的整体测量方法，能实现单颗粒检测，且不受样本光学性质影响，粒径分辨率可达1 nm。 RPS分析原理示意图 第五种方法则是纳米流式细胞（NanoFCM）。传统的流式细胞术通过散射和多色荧光信号对悬液中的颗粒进行检测，能够揭示颗粒的粒径分布、基因以及特异性蛋白的表达等性状。 然而，受限于灵敏度，传统流式难以用来检测直径大小30-150 nm的外泌体。NanoFCM可以检测低至30 nm的外泌体散射光信号，同时，由于NanoFCM采用单粒子逐个测量计数的方式，所以每个粒子的信息都会记录，不仅灵敏度非常高，其分辨率几乎可以媲美电子显微镜。 NanoFCM与TEM、NTA检测结果比较 最后一种方法则是基于ELISA检测原理，依据外泌体表面特定的某一标志物（如CD9、CD63、CD81等）来进行外泌体的定量，这种方法相较于测定蛋白总量，能够区分带有特异性表面膜蛋白的外泌体和非外泌体蛋白，从而实现外泌体含量的快速检测，然而这种方法目前还很少出现在文献中。 基于ELISA的方法测定外泌体原理示意图 文献解读 此外，还有一些研究人员也在积极探索更加准确的定量方法。例如有研究人员认为，脂质双分子层是外泌体不可或缺的组成部分，因此，基于脂质的定量与颗粒计数和/或蛋白质含量相结合，似乎是EV领域的直接且合乎逻辑的方法1。 然而，目前外泌体定量的标准化和归一化问题尚未完全解决，大多数研究主要还是采用蛋白质含量与纳米颗粒数作为依据对外泌体进行量化。很遗憾的是无论是粒子数还是蛋白定量都无法将外泌体与杂蛋白进行有效的区分，但有研究人员做过蛋白对纯度的影响，通过外源添加不同比例的BSA模拟杂质污染2，结果发现BSA对NanoSight检测的particle数量没有太大影响，particle定量结果呈小幅度的先上升后下降趋势，然而蛋白定量结果呈大幅度持续上升状态，表明杂蛋白对蛋白BCA定量结果的影响更大。 最后，我们再看看目前的一些外泌体研究中大家是如何量化外泌体的数量的。首先是目前进行外泌体临床试验，临床试验通常对外泌体的质量、定量结果要求最严格，这里小逸随机查阅了近几年有关外泌体的一些临床试验，其中绝大部分的临床试验主要还是采用粒子数/particles对外泌体进行定量，很少一部分采用外泌体蛋白量进行定量。 此外，我们再看看基础研究中对外泌体的定量方式，这里小逸也是查阅了外泌体相关的高分文章: 1、原文描述：将总体积为100μL PBS的包含10μgCellVue® NIR815（LICOR）标记的EV（PyEV和mEV），经BCA定量并分别对应于NTA测量的2.75E+7,5.46E+7particles，通过眶后静脉窦注射到C57BL/6小鼠（n= 3）3。 2、原文描述：将小鼠随机分为不同治疗组，每只眼滴注5 μl滴眼液，每天2次，连用7天(MSC-exo分别为0.5×1010、2.5×1010、12.5×1010 particles/ml，L929-exo;人工泪液，PBS;L929-NC-miR-exo;或L929-miR-204-exo) 4。 3、原文描述：分别用1 mL生理盐水或溶解了不同浓度的haMSC (2×105, 6×105, 106, 2×106, 6×106, 107 particles) 通过雾化给药的方式处理小鼠5。 4、原文描述：在EV吸收实验中，在玻璃载玻片(ibidi, Fitchburg, WI, USA)上培养的衰老MPCs用pkh -26标记的浓度为1×109 EVsmL的EVs在无外泌体培养基中处理4小时6。 在有关外泌体的表征实验时，通常都会用蛋白含量和NTA粒径结果分别表示；而在涉及一些外泌体给药及功能、机制研究时，研究人员通常将粒子数/particles作为量化依据。这可能给予我们暗示：在外泌体研究过程中通过计算粒子数/particles进行定量不失为更加明智的选择。

没在摸鱼

感谢分享  

liu100812050

感谢分享，终于看到外泌体相关的分享了

18051973248

liu100812050 发表于 2023-11-21 09:45
感谢分享，终于看到外泌体相关的分享了

哈哈哈！这就是缘分。

xqliu

学习了，谢谢提供分享。