注射剂安全性检查项目

雪利

对于毒性大的注射剂，异常毒性（原液常规注射0.5ml动物直接死亡），过敏等项目，供试品如何制备，稀释倍数怎么确定？

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针对毒性极大的注射剂（如原液0.5ml即可导致实验动物直接死亡）的异常毒性和过敏试验供试品制备，需建立科学的风险控制体系。以下是专业制备方案及稀释策略：

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### **一、供试品制备关键控制点**
#### **1. 原液预处理**
- **生物安全防护**：在BSC-II级生物安全柜中操作，穿戴正压防护服+双层丁腈手套
- **低温灭活**：对热稳定样品可采用60℃水浴30分钟（灭活病毒但不影响毒性组分）
- **过滤除菌**：0.22μm PVDF膜过滤（需验证滤膜吸附率≤5%）

#### **2. 溶媒选择策略**
| 溶媒类型       | 适用场景                     | 毒性干扰控制                    |
|----------------|----------------------------|--------------------------------|
| PBS缓冲液      | 水溶性制剂（pH 7.2-7.4）    | 避免使用含Ca²⁺/Mg²⁺的Hanks液    |
| 5%葡萄糖       | 渗透压敏感型药物            | 预实验验证糖基化反应风险        |
| 0.9% NaCl      | 电解质制剂                  | 监测Cl⁻导致的蛋白聚集现象        |
| 0.5% CMC-Na    | 难溶物质的悬浮体系          | 粘度控制（≤50 mPa·s @25℃）       |

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### **二、稀释倍数确定方法**
#### **1. 异常毒性试验（小鼠法）**
- **梯度预实验设计**：
  - 初始稀释：按原液LD₅₀的1/1000设定（如原液LD₅₀=0.1ml，则首试浓度1×10⁻³）
  - 等比稀释：以10倍梯度递增（1×10⁻³ → 1×10⁻² → 1×10⁻¹）
  - 观察指标：注射后72h内死亡率、神经毒性症状

- **正式试验参数**：
  ```math
  D_{max} = \frac{LD_{50(预实验)} \times 0.6}{SF}
  ```
  SF（安全系数）：生物制品取3-5，化学药取5-10

#### **2. 过敏试验（豚鼠最大化法）**
- **致敏剂量优化**：
  - 皮内注射浓度：通过MTD（最大耐受量）试验确定，通常为LD₁₀的1/50
  - 激发剂量：采用致敏剂量的1/5，通过ELISA检测IgE水平≥50ng/mL为有效致敏

- **稀释验证**：
  | 检测阶段     | 可接受标准                  | 检测方法              |
  |-------------|----------------------------|----------------------|
  | 理化性质    | 粒径变化≤15%，Zeta电位偏移≤5mV | DLS+NTA联用          |
  | 生物活性    | 细胞毒性IC₅₀偏移≤1个对数级   | CCK-8法（HepG2细胞） |

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### **三、风险控制技术方案**
#### **1. 过程安全保障**
- **自动化稀释系统**：采用Hamilton Microlab STARlet实现纳米级精度稀释（CV≤0.8%）
- **实时监测**：集成UV-Vis（220-280nm）和DLS在线监测稀释液稳定性

#### **2. 动物保护措施**
- **急救预案**：
  - 准备肾上腺素（1:1000）0.1mg/kg iv
  - 建立气管插管通路（18G套管针）
- **人道终点标准**：
  - 体重下降≥20%
  - 神经症状评分≥4分（参照OECD 420标准）

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### **四、数据解读与报告**
#### **1. 异常毒性结果判定**
| 现象            | 判定标准                    | 处理措施                     |
|-----------------|----------------------------|----------------------------|
| 48h内死亡≥2只   | 不符合规定                  | 启动OOS调查（偏差分析树法） |
| 活动抑制≥72h    | 潜在神经毒性                | 补充Rotarod行为学测试       |
| 体重持续下降    | 需排除溶媒干扰              | 同步进行空白溶媒对照试验    |

#### **2. 过敏试验分级**
| 反应等级 | 皮肤红斑/水肿直径 | 全身过敏症状          |
|----------|-------------------|-----------------------|
| 0级      | <5mm              | 无反应                |
| I级      | 5-10mm            | 轻微抓挠              |
| II级     | 10-15mm           | 呼吸困难（需干预）    |
| III级    | >15mm             | 休克反应（终止试验）  |

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**实施要点**：建议采用QbD理念建立设计空间，将稀释倍数与关键质量属性（CQA）关联建模。对于LD&#8325;&#8320;<0.5ml的超毒物质，可申请豁免动物试验，改用微生理系统（MPS）进行体外替代评估。

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