浅析微生物鉴定在污染调查中的应用

石决明

浅析微生物鉴定在污染调查中的应用

摘要：通过对生化水平、基因水平和质谱微生物鉴定系统的介绍分析，比较了不同微生物鉴定系统的优缺点，讨论其在污染调查中的应用。针对生化水平和质谱微生物鉴定系统不能鉴定的微生物，不一定要选择基因水平鉴定，可以选择进行图谱溯源和消毒剂杀灭试验达到清除污染的效果。

关键词：微生物鉴定，污染调查

按照我国GMP要求，药品生产企业对生产环节的微生物污染需要定期监控。现有的药典和洁净室环境检测要求，通过微生物限度检查，无菌检查，沉降菌监测，浮游菌监测，接触碟和手套等多种手段收集污染微生物，得到量化的数据。而微生物鉴定通过鉴定不同来源的微生物的种类，起到溯源调查、从源头控制污染和选择合适的消毒剂的作用[1]。

随着对鉴定效率的不断提高，自动化程度较高的商业化微生物鉴定系统逐步占据市场。法国梅里埃公司的Vitek2 Compact在2005版药典中被提及。2014年10月，美国Biolog公司GEN III MicroStation型自动微生物鉴定系统在中国食品药品检定研究院化学药品检定所微生物检测室正式投入使用。2013年8月，FDA批准首个质谱仪系统VITEK MS用于鉴定细菌和真菌。微生物鉴定所需时间从小时正式进入分钟计算。但是，这些种类繁多的微生物鉴定系统真正能达到100%鉴定吗？鉴定出的结果如何能更好的利用于污染调查？本文将介绍不同的微生物鉴定系统及其在污染调查中的应用。

1.        生化水平鉴定

目前市场上比较多用的生化反应鉴定系统有API，Phoenix-100，VITEK2 Compact和Biolog。从基本原理上，API，Phoenix-100，VITEK2 Compact系统就是生理生化方法的仪器化操作。通过固定在不同种类检测卡的数十种生化反应底物与待检菌进行反应，将待检菌的生理生化结果与数据库中的结果进行比对，得出相似度在一定数值的结果，得出鉴定结果。优点是可同时进行多种生理生化测试，不需要人工配制多种生化反应底物；全程机器培养判读，避免经验不足影响人工判读；检测时间缩小到小时级别。而Biolog系统通过检测待测细菌对95种不同碳源的代谢情况,分析细菌的代谢过程,并通过对系统数据库的检索实现对待测纯系菌株的快速鉴定。

通过使用发现，由于还是生理生化反应的结果，不同培养时间的菌落检测结果不一致；不同系统的生化反应由于公司壁垒互有不同，鉴别结果有不一致的现象；各种菌种数据库比较小，只有几百种左右，如表1所示最多的Biolog系统也仅有2700种；鉴定结果的相似度也有高有低，甚至不能鉴定。遇到相似度比较低或不能鉴定的情况，无法判断鉴定结果是否有效。要想起到溯源的效果，可以手动将卡位中的生理生化结果记录下来。

Table1 Microbial database comparison of different identification systems

表1 不同鉴定系统菌种数据库比较

鉴定系统	菌种数据库
API	600
Phoenix-100	350（170种以上革兰阴性菌，150种以上革兰阳性菌，30种链球菌）
VITEK2 Compact	517（120种革兰阳性菌   145革兰阴性菌，嗜血杆菌等26种，厌氧菌-棒状杆菌63种，酵母菌52种菌，需氧芽孢杆菌47种，棒状杆菌64种）
Biolog	2700（1388种好氧细菌、361种厌氧菌、267种酵母、708种丝状真菌）

2.        基因水平鉴定

16SrRNA基因序列在微生物中有广泛的保守性和序列多态性，可以显示微生物的亲缘关系和进化特征，是现有条件下微生物分类学研究的重要手段。鉴定流程是菌落基因组提取，通过16SrRNA通用引物扩增得到16SrDNA，用T-克隆载体进行PCR产物克隆，送测序公司测序，测序结果与GenBank数据进行BLAST比对，得到相似度从高到底的鉴定结果。

由于最后的测序结果要用于比对，为了减少基因突变，必须选择保真度高的PCR聚合酶。New England Biolabs的科学家测定Taq聚合酶的错误率为2.7x10-4± 0.8x10-4，或每3700个碱基1个错误。这些数据表明，利用Taq以25个PCR循环扩增400 bp的片段，可能一半的克隆都带有错误。对于较大的片段如1 kb左右的16SrRNA基因序列，每个克隆都可能带有不想要的突变。

鉴定流程中会涉及很多分子生物学物料，如果仔细研究说明书会发现多有“本产品仅供科研使用”或“this product is intended to be used for research only. They are notto be used for drug or diagnostic purpose.”的警示标志。 能否用于最后的判定还是仅作为参考还有待商榷。

BLAST比对的数据库GenBank为公用序列数据库，收录基因来源门槛极低，存在收录的基因质量不稳定，某些序列命名错误等种种问题。陈源源等从GenBank数据库中收集了细菌16S rDNA序列、丝状真菌ITS序列以及酵母26S rDNA D1/D2区域序列共88条,结果发现有17条序列（19.3%）的长度过短,无法提供足够的系统发育信息;5条序列（5.6%）存在错误命名或测序不准确问题;58条序列（65.9%）没有相关文章发表;62条序列（70.4%）无法获取对应的微生物保藏物[2]。从而提示了GenBank数据库的有限参考价值。Life公司等也根据自有的PCR体系及测序系统准备了商业化数据库  但是数量还是不能与GenBank相比，而且是搭配机器购买收费昂贵。

3.        MALDI-TOF质谱鉴定

MALDI-TOF质谱实现软电离，借助化学基质分析蛋白质。DHB（dihydroxybenzoic acid）最适合分析糖苷和糖蛋白，芥子酸最适合高分子量蛋白，CHCA（a-cyano-4-hydroxycinnamicacid）最适合低分子量蛋白。激光造成样本和基质的挥发，形成的离子被高电压加速并在飞行管中以不同质量分开，在飞行管末端进行检测，得到全细胞的蛋白谱。

2013年8月21日美国食品和药品监督管理局(FDA)允许第一个质谱系统VITEK MS为自动鉴定已知在人类中致严重疾病细菌和和酵母菌。VITEK MS可鉴定193种不同的微生物和可在单一自动化测试系列中进行至192种不同的测试，每个测试花费约一分钟。一般认为，不同菌种具有不同谱图。但是蛋白质谱是否能等同于基因图谱具有唯一性，还有待进一步研究。至于项新型申请,FDA决议是基于一项7068种微生物研究结果,。相比排序和生化检测,VITEK MS可以将87.5%的微生物鉴别到种属的水平。研究中VITEK MS为对3.2%的微生物提供“无标识”结果。在所有的测试结果中,只有0.8%的微生物鉴别是不正确的，也只有2.4%鉴别结果与正确结果有低的区分力。孟冬娅等在比较并评价两种商业化MALDI-TOF MS系统中发现，VITEK MS会对表2中的3种菌鉴别出错误结果[3]。由于在严重疾病诊断过程中体现出极大的时间优势，MALDI-TOF质谱已经被各大医院所配置使用。

Table 2 Falseidentification result from VITEK MS

表2 VITEK MS鉴定错误结果

菌株	VITEK MS鉴定结果
宋内志贺菌	大肠埃希菌
树状微杆菌	大分戈尔德菌
血链球菌	血液链球菌

4.        微生物鉴定在污染调查中的应用

通过以上各种鉴定方法的比较，不难发现不论是生化水平鉴定还是质谱鉴定，在现有的条件下都存在一定的不足，仪器厂家也在针对这些问题进行不懈的研究和进一步的开发。而基因水平的检测由于专业性较高，操作难度较大，还不能大范围的应用。而且基因检测的结果是否具有判断的效力还需要行业更进一步的规范。但是，如果在我们污染调查中遇到无法鉴定或者鉴定相似度不高的结果时，应该如何处理呢？其实，在污染调查中我们进行微生物鉴定，主要目的是想获得菌种的详细信息：便于发现在其他地方或者过去是否出现过，可以调查污染出现的源头。而且可以根据菌种的类型选择合适的消毒剂达到清除污染的效果。如果无法获得鉴定结果，以质谱系统为例，可以获得待检菌的质谱图用于溯源比对。同时，选择一些不同类型的消毒剂进行杀灭试验，获得有效的消毒剂种类和作用浓度，也可以达到杀灭的效果。

如图1所示，微生物污染调查可以按照流程图进行。同时，必须强调革兰氏染色和镜检在商业化检测之前的重要性[4]。正确的形态学结果是选择不同鉴定卡（生化鉴定）和不同基质（质谱鉴定）的基础，选择错误将直接导致鉴定无效（无法鉴定或鉴定错误）。在一些生化鉴定仪器的专家系统中，也常常要求进行补充生化试验来提供更进一步的判断依据。

图1

图1 微生物污染调查流程图

Figure 1 Microbial contaminationinvestigation flowchart

随着药品行业和监管机构对微生物污染的不断重视，微生物鉴定的手段在不断推陈出新，鉴定的速度在飞速的提高。但是，面对名目繁多的鉴定手段，一定不要忘记为什么鉴定的本来目的。从单一的药品生产企业来说，也没有必要建立那些比较大型的鉴定系统，如何利用好自己的鉴定手段建立自己的判断规则才是明智之选。如果遇到特别顽固的污染菌污染，可以选择专业的鉴定机构进行基因水平的鉴定。

参考文献

[1] 范一灵，房蕊，蒋波,等. 微生物鉴定分型技术应用于医药企业微生物污染调查[J].中国医药工业杂志，2010，41（11）:810-822

[2] 陈源源 沈微 樊游，等.GenBank数据库中微生物rDNA序列准确性研究[J]. 食品与发酵工业，2012，38(3)：29-31

[3] 孟冬娅，任微，罗艳萍，等. 两种MALDI-TOF质谱仪对临床分离细菌鉴定结果的比较[J/CD]. 中华实验和临床感染病杂志：电子版，2014，8（2）：178-182.

[4] 陈东科. 加强形态学检查提高细菌鉴定的准确性[J].实验与检验医学：2012,30(5)：419-422

syhorchid

谢谢分享

小冰冰

溯源技术要求太高，一般企业负担不了