新药研发战场上的“狙击步枪”——单晶培养与结构解析

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苏州晶云药物科技有限公司近日发布了关于单晶培养与结构解析的实用干货，欢迎大家阅读并交流意见，以下为原文：

结构决定性质，几百年来，人们对化合物结构的探索，犹如人类的军备竞赛，始终没有停歇过它的脚步。尤其是进入20世纪以来，红外，紫外，质谱，核磁，单晶衍射等技术手段的纷纷登场，为人们探索化合物的结构提供了众多的先进武器。而在这些技术中，X-ray衍射单晶结构分析（SC-XRD）像是一把狙击步枪，它为探究化合物结构提供了一种精准的作战解决方案。近些年，这把狙击步枪在药物研究与开发的战场上，正不断地展现出其无与伦比的作战价值。

下面小编就以手性药物分子的绝对构型确证为例，向大家介绍下X-ray衍射单晶结构分析方法这一“利器”是如何在药物研发中发挥它的作用的。概括的来讲，要确定一个药物分子的绝对构型，我们可以分成三步来走：

1单晶培养

想用“狙击步枪”消灭敌人，首先要有子弹，这就需要得到药物分子的单晶样品。 而“狙击步枪”精准的特性要求它所用的子弹需要加工精确而又稳定。什么样的药物分子比较合适培养单晶呢？通常情况下，药物分子要有比较好的结晶性能，如果药物分子特别容易以无定形或者是油状液体的形式存在，那么培养单晶将是比较困难的，同时针对绝对构型确证，我们还希望药物分子的元素组成中能有较重的原子，一般需要有原子序数大于Si的原子，才能有比较大的把握确定绝对构型，这一点非常重要，小编将在后面的结构解析部分做详细解释。

那么如何生产得到高质量的子弹(培养单晶)？常规的方法主要包括缓慢挥发，气液渗透，缓慢降温与液面扩散。对于药物分子特别容易形成无定形或是药物分子本身不含重原子的情况，我们还可以尝试些特殊的方式，比如培养API的盐型或者共晶的单晶(如果与之成盐或共晶的配体同时还含有重原子，比如盐酸盐，那么就更加有利于API绝对构型的确证)，另外对于一些特别的化合物，还可尝试培养API的金属配合物来得到单晶。

2单晶衍射数据收集

得到单晶样品之后，下一步就是将“子弹”上膛，收集单晶衍射数据，如同高精度的狙击步枪总是栓动式的，需要手动单发上弹一样。单晶衍射数据收集的过程，从上样到最后的数据还原，一般需要五六个小时到十几个小时不等，而且每一步都需要保证精确，这期间性能优异，高分辨率(高精度)，高亮度的(子弹穿透力强) 单晶衍射仪是必须的，这样才能保证我们得到高质量的衍射数据。

3结构解析

对于狙击作战而言，高品质的子弹(单晶样品)以及高精度的狙击步枪(单晶衍射仪)是成败的重要因素，但要想顺利完成任务，狙击手对目标细致而准确的剖析同样是不可或缺的，这就是单晶结构解析。而这部分的工作大致可分成：结构初解与结构精修。所谓的结构初解是将衍射数据通过傅里叶变换转化成空间电子云密度图继而获得部分或全部原子的坐标。结构精修是在结构初解得到的结构模型的基础上进行最小二乘精修，最终获得空间全部原子的精确坐标及位移参数。

那手性分子的绝对构型又是如何被确定下来的呢？概括起来主要有两点：

化合物的绝对构型与晶体的绝对结构的联系，确定了晶体的绝对结构就可以确定化合物的绝对构型；

原子核外电子对X-ray的反常散射效应，利用这一效应就可以确定晶体绝对结构，继而确定化合物分子的绝对构型。

(*有兴趣的朋友可以阅读《单晶结构分析原理与实践》陈晓明，蔡继文编著)

原理上理清楚了，那具体如何进行操作，目前晶体学界广泛采用是H.D. Flack教授在1983年提出的方法。即在结构精修的过程中加入一个参数x(μ)，称为Flack参数，μ表示该参数的不确定度或者标准偏差。

如果最终解析的结果中Flack参数可以满足如下两条标准，那么我们就可以说晶体的绝对结构是正确的，继而可以用该晶体结构去证明我们化合物的绝对构型了。

不确定度μ较小（ μ <0.04，对于以光学纯的API进行单晶培养得到的晶体可以放宽到0.1）

x要求非常接近0（|x|/μ<3.0，一般要求x<0.1）

这种方法是目前国际晶体学界普遍认同的标准方法。但是，在通常的实际测试工作中，特别是当化合物晶体只由C、H、N、O等轻元素组成的时候，结果常常并不理想，原因在于轻元素的反常散射效应不明显。实践中发现，即使采用Cu/Ka射线作为入射X-射线光源，这类轻元素晶体结构的Flack参数偏差也常常落在0.1-0.2的区间，这与理想情况（偏差低于0.1）有较大的差距，从而影响了绝对构型测定的可靠性；至于采用Mo/Ka作为入射X-射线光源，那么这类轻元素晶体结构的Flack参数偏差将毫无意义，因而无法测定绝对构型，这就是为什么测定绝对构型一般要求化合物的组成元素中含有原子序号大于Si的元素。但是，在实际工作中，特别是某些天然产物，通常只由C、H、N、O等轻元素组成，且不易或不适合做S或卤素的衍生化，如果采用传统的Flack参数法，通常不易可靠地测定绝对构型。（**参考中国科学院化学研究所《分析测试中心通讯》第7期：绝对构型测定的新进展）

于是，Hooft教授等人在2008年提出了一套新的测定方法。该方法的主要思路并非通过单一参数来判定绝对构型测定的可靠性，而是采用概率的方法，给出绝对构型被正确测定的概率，目前这一方法已经植入到了晶体学通用程序PLATON，大家可以在PLATON程序的Bijvoet Pairs功能中进行计算。

Hooft法同Flack方法的根本差别在于，前者是概率的方法，并非通过单一参数，即Hooft参数判定结果的可靠性，而是给出绝对构型被正确测定的概率，这个概率是一个可以连续变化的百分数。对比而言，Flack方法更象是一种非此即彼的方法，当Flack参数合理，则结果可信，否则结果不可信，当Flack参数介于合理和不合理之间的时候，结果很“模糊”。Hooft方法主要通过以下指标来评判绝对构型的确定情况：

Hooft y：该参数类似于Flack参数

P2(right) & P2(wrong)：在我们已经知用来培养单晶的API物料是手性纯的前提下， P2(right)表示化合物真实绝对构型是目前单晶结构数据给出的这一构型的概率，而P2(wrong)表示不是这个构型的概率。

P3(right) & P3(wrong) & P3(twin)：在我们用来培养单晶样品的API物料不是手性纯的情况下，P3(right) 表示化合物真实绝对构型是目前单晶结构数据给出的这一构型的概率，而P3(wrong)表示不是这个构型的概率，P3(twin)表示该单晶是50%/50%倒反孪晶的概率。(前提是我们可以确定不出现其他比例的倒反孪晶的情况)

Hooft教授等人另辟蹊径提出的这套确定绝对构型的方法在很多方面表现出了诸多优点，尤其是对于只含有C、H、O、N元素的晶体的绝对构型确定，Hooft方法比Flack法具有更高的适应性和可靠性，也这正因如此，该方法正不断的为大家所认识到并接受，但从目前来看学术界普遍接受的标准方法还是Flack法，hooft方法确定的绝对构型结论是否为FDA所接受，小编这里还不清楚，也希望如果大家有这方面的信息或者资料可以分享给小编。

讲到这里，相信大家对于X-ray 衍射单晶结构分析已经有了一个比较形象的认识，小编也相信，随着这一技术的不断迭代更新与普及，未来它必定会在药物开发的战场上为各位“指挥官们”提供更强有力的火力支援。

原文链接见： http://www.crystalpharmatech.com.cn/2016year/288.html