关于菌种长期保存的问题

完全可能

大肠杆菌，三级菌种库的菌种长期保存的话，是用那种方式？在审核角度来看是那种更好?

飞凌大圣

液氮最优，-80℃冰箱可以，-40℃冰箱也行。温度越高，保存时间越短；温度越高，变异的可能性越大！

布偶

有条件冻干也不错。

完全可能

飞凌大圣 发表于 2019-9-4 11:41
液氮最优，-80℃冰箱可以，-40℃冰箱也行。温度越高，保存时间越短；温度越高，变异的可能性越大！

那种方式呢？甘油？冻干？还是其他？

完全可能

布偶 发表于 2019-9-4 13:26
有条件冻干也不错。

那种条件处理下保存时间最长？甘油可以长期保存么？

布偶

完全可能 发表于 2019-9-4 14:22
那种条件处理下保存时间最长？甘油可以长期保存么？

具体我也不清楚，保存时间也不单是方法决定的，保存时各种条件都有影响。要综合自身条件技术考虑，目前我们自己用的冻干保存。
真空冷冻干燥保藏法
1准备安培管 用于真空冷冻菌种保藏的安培管宜采用中性玻璃制造，形状可用长颈球形底的，亦称泪滴型安培管。大小要求外径6～7.5mm，长105 mm，球部直径9～11 mm，壁厚0.6～1.2 mm，也可用没有球部的管状安培管。塞好棉塞，在压力0.11MPa，温度121℃条件下灭菌30min后备用。
2准备菌种 用真空冷冻干燥法保藏的菌种保藏期可长达几年甚至几十年，为了不出现差错，所用菌种纯度要高，而且菌龄要适宜。细菌和酵母菌的菌龄要求超过对数生长期，若用对数生长期的菌种进行保藏，其存活期反而降低。一般细菌的菌龄要求24～48h；酵母菌为3d；形成孢子的微生物则宜保藏孢子；放线菌和丝状真菌菌龄为7～10d。
3制备菌悬液与分装 以细菌斜面为例，用脱脂牛乳2mL左右加入试管中，制成浓菌液，每支安培管分装0.2mL。
4冷冻 冷冻干燥器有成套的装置出售，但价格昂贵。此处介绍的是简易的方法与装置，可达到同样的目的。
将分装好的安培管放低温冰箱 中冻结，无低温冰箱 可用冷冻剂如干冰（固体CO2）酒精液或干冰丙酮液，温度可达－70℃。将安培管插入冷冻剂，只需冷冻几分钟，即可使悬液结冰。
5真空干燥 为在真空干燥时使样品保持冻结状态，需准备冷冻槽，槽内放碎冰和食盐，混合均匀，可冷至－15℃。安培瓶冷冻槽的干燥瓶内。
6抽气 一般若在30min内能达到93.3Pa（0.7mmHg）真空度时，则干燥物不致溶化，以后继续抽气，几小时内，肉眼可观察到被干燥物以趋干燥，一般抽到真空度26.7Pa（0.2mmHg），保持压力6~7h即可。
7封口 抽真空干燥后，取出安培瓶，接在封口用的玻璃管上，可用L形五通管继续抽气，约10min即可达到26.7Pa（0.2mmHg）。于真空状态下，以煤气喷灯的细火焰在安培管颈中央进行封口。封口以后，保存于冰箱或室温暗处。
此法为菌种保藏方法中最有效的方法之一，对一般生活力强的微生物及其孢子都适用，即使对一些很难保存的致病菌，如脑膜炎球与淋病球菌等亦能保存。此法适用于菌种的长期保存，一般可保存数年至几十年。缺点是设备和操作都比较复杂。
液氮超低温保藏法
液氮保藏法是目前保存微生物菌种最可靠的方法，多数国家级菌种保藏单位都采用此法。
1准备安培管 用于液氮保藏的安培管，要求能耐受温度突然变化而不致破裂，因此，需要采用硼硅酸盐玻璃制造的安培管。安培管的大小通常使用75×10mm的安培瓶。
2加保护剂与灭菌 保存细菌、酵母菌或霉菌孢子等容易分散的细胞时，则将空安培管塞上棉塞，在压力0.11MPa，温度121℃条件下灭菌15min；若保存霉菌菌丝体则需在安培管内预先加入保护剂，如10%的甘油蒸馏 水溶液或10%二甲亚砜蒸馏水溶液，加入量以能浸没以后加入的菌种块为限，而后再进行高压灭菌。
3接入菌种 将菌种用10%的甘油蒸馏水溶液制成菌悬液，装入已灭菌的安培管；霉菌菌丝体则可用灭菌打孔器，从平板内切取菌落圆块，放入含有保护剂的安培管内，然后用火焰熔封。浸入水中检查有无漏洞。
4冻结 再将已封口的安培管以每分钟下降1℃的慢速冻结至－30℃。若细胞急剧冷冻，则在细胞内会形成冰的结晶，因而降低存活率。
5保藏 经冻结至－30℃ 的安培管立即放入液氮冷冻保藏器的小圆筒内，然后再将小圆筒放入液氮保藏器内。液氮保藏器内的气相为－150℃，液态氮为－196℃。
6恢复培养 保藏的菌种需要用时，将安培管取出，立即放入38～40℃的水浴 中进行急剧解冻，直到全部融化为止。再打开安培管，将内容物移到适宜的培养基上培养。
此法除了适宜于一般微生物的保藏外，对于一些用冷冻干燥法都难以保藏的微生物如支原体、衣原体、氢细菌、难以形成孢子的霉菌、噬菌体及动物细胞都可长期保藏，而且不易发生变异。缺点是需要特殊设备。

完全可能

布偶 发表于 2019-9-4 14:37
具体我也不清楚，保存时间也不单是方法决定的，保存时各种条件都有影响。要综合自身条件技术考虑，目前我 ...

十分感谢，非常有用

zhuWL

布偶 发表于 2019-9-4 14:37
具体我也不清楚，保存时间也不单是方法决定的，保存时各种条件都有影响。要综合自身条件技术考虑，目前我 ...

请教一下：原本-80℃保存的甘油菌（甘油比例10%）可以转入到液氮中保存吗？
保存的温度越低，是不是甘油的比例就要相对高一点？

布偶

zhuWL 发表于 2019-9-16 16:18
请教一下：原本-80℃保存的甘油菌（甘油比例10%）可以转入到液氮中保存吗？
保存的温度越低，是不是甘油 ...

不太了解哎，木虫上有个想关是说-80℃转到液氮好像不是很理想，不过那是细胞。 具体实施你可以试验一下，复壮后再在液氮中保存。至于甘油比例-80℃或者液氮保存有见过说是10%-30%的，甚至有说40%，条件可以探索下，查询下你自己菌种的相关文献。

小金库

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