寡核苷酸纯化，该怎么办？

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寡核苷酸纯化，该怎么办？

作者：汉邦科技-庆无影（BLA联合发起单位）

在之前的文章《核酸合成&纯化平台化解决方案》和《核酸合成，我们会聊些什么？》中，小编和大家分享了寡核苷酸合成以及在合成过程中我们会面临的一些问题，聊完了合成，我们自然而然会想到寡核苷酸的纯化问题，那么对于工业级别的寡核苷酸纯化，一般又有哪些方法呢？且听小编跟您慢慢分享。

一、寡核苷酸原料生产工艺

首先，我们在此跟您简单梳理下寡核苷酸原料的生产工艺流程，了解寡核苷酸纯化的上下游情况。针对寡核苷酸纯化的上游也就是合成阶段，目前主流合成方法是采用固相亚磷酰胺三酯法。其中，亚磷酰胺单体与固相载体在核酸合成仪中经历脱保护，耦合，氧化，盖帽等步骤得到事先设定好的碱基序列，即寡核苷酸粗品，随后需要对粗品进行脱除保护基并从固相载体上切割下来。目前可以通过分析液相色谱设备去对粗品纯度进行初步检测，然后再经纯化、超滤和冻干等步骤得到中间体。以下以siRNA原料药生产工艺流程为例：

  资料来源：苏州瑞博公开资料整理

二、核酸药物分类

截至目前，全球已经获批上市的小核酸药物共有14种，其中9款ASO，4款siRNA药物和1款核酸适配体。此外还有279款药物在研，但是60%仍处于临床阶段。通过固相合成的方法得到的不同类型的核酸药物诸如ASO，siRNA，miRNA等，其对应分子量也不尽相同。

跟传统小分子药物的分子量通常在＜500Da以及生物大分子抗体类药物的分子量通常在＞100,000Da相比，核酸药物的分子量介于小分子以及生物大分子分子量之间，通常介于7,000~14,000Da之间，当然也跟其对应碱基序列长度有关系。小编也在此梳理了目前市面上常见的核酸药物类型及其对应分子量的大小。

三、寡核苷酸纯化方式

相较于传统的小分子化药和生物大分子抗体类药物，由于核酸药物分子量介于小分子化药和生物大分子药物之间，也就决定了其纯化方式的特殊性。目前主流的纯化方式有反相色谱法和离子交换层析的方法，国外Ionis公司相关人员也在研究使用疏水层析结合离子交换的方法进行纯化，但是目前问世的核酸药物多数是利用反相色谱或者离子交换层析的方法进行纯化的，还没有对应的核酸药物是经过使用疏水层析结合离子交换层析方法纯化获得。下图列举了三种不同的纯化方法：

A：反相色谱法

B：离子交换色谱法

C：疏水层析+离子交换层析法

资料来源：Ionis公司公开资料

在利用反相色谱法的时候，主要工艺步骤为固相合成→反相色谱纯化→脱三苯甲基化→各种沉淀法（如乙醇沉淀）→冻干。在使用此方法的时候需要使用有机溶剂，对应的需要对废液进行处理，纯化设备需要进行防爆处理。
在利用离子交换层析方法时,主要工艺步骤为固相合成→离子交换层析→浓缩/深层过滤→冻干。在此纯化过程中，脱三苯甲基化环节需要在纯化柱中进行（On Column脱三苯甲基化），这里的离子交换主要是强阴离子交换的方法。目前通过反相色谱法或者离子交换层析方法进行纯化都有对应的核酸药物问世，这也是目前主流的两种纯化方法。

在进行新的纯化方法的开发上，科学家们也从未停止脚步，有专家提出使用疏水层析加离子交换的方法进行纯化。具体工艺步骤为固相合成→疏水层析→脱三苯甲基化（On Column脱三苯甲基化）→离子交换→UF/DF→原料药溶液。与反相色谱法相比，使用疏水层析可以去除固相合成时从固相导出的样品溶液中含有的氢氧化铵等低分子，可以分离目标产物的相关杂质，即N-1杂质、N+1杂质、P=0杂质、氰乙基化 (CNEt) 杂质、无碱基杂质等，且洗脱液几乎不使用有机溶剂，减少了有机溶剂的使用成本。

【关于汉邦科技】

江苏汉邦科技有限公司，成立于1998年，是集研发、生产和贸易为一体，以色谱产品为核心的国家级重点高新技术企业。主要产品有：实验室高效液相色谱系统、工业制备液相色谱系统、模拟移动床色谱系统、连续离交色谱系统、超临界流体色谱系统、生物制药下游纯化设备及提供以色谱产品为核心的整体化解决方案与服务。药明康德与君联资本、红杉资本先后入股汉邦科技，进一步推动公司在生物医药行业的发展。
公司现有员工500余人，其中：博士、硕士40多人，大学以上学历人员占员工总数80%以上。先后成立 “江苏省生物化学过程工程技术研究中心”、“江苏省工业制备色谱工程中心”、“江苏省企业研究生工作站”和“江苏省博士后创新实践基地”，2020年获批国家专精特新“小巨人”称号。建立了一支集纯化工艺、分离材料、机械设计、软件设计等多专业60多人的专职研发团队，构建了一个强大的“产、学、研、用”平台，汇聚了一批专家、学者，可为客户提供从产品定制到工艺开发、工程设计、总装调试和系统验证的交钥匙工程。

公司先后承担国家和省级项目20多项，拥有200多项知识产权成果，建立了生产过程质量可追溯体系，从原料采购、加工制造、质量检验和安装售后每一个环节严格管控，保证产品符合GMP、cGMP及FDA等法规要求。先后通过ISO9001质量体系认证、ISO14001环境体系认证、OHSAS18001职业健康体系认证、欧盟CE认证和ATEX防爆认证。

【关于BLA】

生物制药国产化推进联合会，英文全称Biopharma Localization Association，缩写BLA。由生物制药研发、生产企业及服务商（含生物制药上下游各细分领域）等共同发起组成，联合会为推

动生物制药国产化而生。BLA目标：使BLA成为中国生物制药企业信赖的组织。BLA，for Biopharma，for China.

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