生物制药的科学清洗 第二篇

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如何解决生物制药缓冲液配制罐中的“白环”现象

生物制剂多以生物大分子（如抗体蛋白）或更为复杂的生物结构（如ADC，CAR-T，mRNA-LNP，腺相关病毒载体等）作为其药物活性成分，而生物大分子在体系pH值波动时，极易发生pH依赖的降解（如脱酰胺等），进而导致药物活性成分变性失活。因此，在生物制剂的生产、储存及运输过程中，往往需要配制不同的缓冲液将pH值控制在一定范围内，从而在细胞培养、蛋白纯化和制剂制备等工艺步骤中稳定反应体系，保护抗体等生物大分子的理化性质和生物活性。

然而，缓冲液（主要是无机盐、水溶性有机物等）制造中往往有两个相当常见的问题：一个是不锈钢的缓冲液配制罐内表面钝化膜消失与红锈形成，此前已做过多次分享并可在精川前期的文章里找到对应解决方案，此次不做过多探讨；另一个则是在用于制造缓冲液的配制罐内会有白色的环形成，这也是本次分享探讨的主题。这种白环通常出现在罐壁、搅拌器轴的气液交界面上。此现象不一定在生产一批产品之后就出现，也可能需要历经多个批次后肉眼才能清楚地看到白色环。而且不仅仅是某一种缓冲液配方会出现这些白环，不同的缓冲液配方在不同程度上均会发生此现象（如下图所示）

对于缓冲液配制罐的清洁，行业中一种常见的做法是只用注射用水（WFI）清洗。采用这种清洗方式的主要原因是，考虑到缓冲液都只含有水溶性物质，因此残留物质应该很容易被水溶解去除。但是，白环现象既然已经出现，表明缓冲液中一定存在一些非水溶性的其他物质，才能形成这些白环，常规清洗手段显然不再适用。为更有效地去除白环，我们需要先探明此现象形成的原因，了解这种白色物质是什么，才能寻找到适合的清洁方法。

众所周知，这些物质在绝大多数情况下是包装缓冲液原料的塑料袋子（通常为聚乙烯材料）在生产过程中加入的各种润滑剂的混合物，在各种因素作用下，这些润滑剂转移到了袋内的产品中。然后，当其被加入用于缓冲液生产的配制罐中时，不溶于水的润滑剂就漂浮到顶部，并附着在罐壁和搅拌器轴上。这些润滑剂通常是各类脂肪酸酰胺，如芥酸酰胺、油酸酰胺和硬脂酰胺。

那么，何为润滑剂，又为何要添加呢？

润滑剂是在薄膜形成之前添加到塑料中的物质可以使得两片聚乙烯薄膜在加工过程中相互滑动。润滑剂也可用作抗粘结剂（粘结是指两个塑料互相粘连、不易分离的现象，这两种现象都与摩擦力有关）。润滑剂被加入到塑料中，待薄膜形成后，它们倾向于迁移到膜的表面位置，以便薄膜之间相互滑动、不会粘结。而聚乙烯薄膜作为包装缓冲液成分的袋子中的内衬，显然其表面的润滑剂在运输和储存过程中有很大概率会转移到袋内的物质中。

聚乙烯中最常见的润滑剂是芥酸酰胺和油酸酰胺。硬脂酰胺也有被使用，但与其他两种相比使用频率较低。因为芥酸酰胺和油酸酰胺在材料中发挥作用和提供保护的速度方面略有不同，有时它们也会组合使用。芥酸酰胺和油酸酰胺都是不饱和脂肪酰胺，熔点约为70-80°C。而硬脂酰胺是一种饱和脂肪酰胺，熔点就高得多。此类酰胺均可进行碱性或酸性水解，但水解所得的脂肪酸在中性pH值和室温下不溶于水。

由此可以推测出至少有两种机制能防止白环（可能是脂肪酰胺或脂肪酸本身）沉积。一种是，当温度接近脂肪酰胺的熔点时，脂肪酰胺可以被液化，然后在碱性清洁剂的作用下发生乳化。另一种是在高（或低）pH和温度升高的条件下，脂肪酰胺从表面水解成脂肪酸，然后与碱性的KOH或NaOH形成脂肪酸盐，形成的脂肪酸盐是可溶的，但是在相同条件下，KOH作为碱度来源比NaOH更好，因为钾盐普遍比钠盐更易溶解。所以，清洁白环的最有效解决方案是在至少70°C的温度下使用含KOH的复合配方碱性清洁剂，随后使用复合配方酸性清洁剂，例如可以先使用1~5%浓度的JClean 1000进行碱洗，再使用1~2%浓度的JClean 2000/2100进行酸洗。然而，在高温下仅用NaOH清洗通常是无效的。

目前，对于白环清洗而言，并没有一个既定的清洗工艺参数。因为从包装袋转移到缓冲液原料再转移到设备表面的润滑剂的量并不会一成不变。例如，缓冲液浓度越高，产生更多白环沉积的可能性也就越大。基于批量大小与表面积的比率，更大的批量也更可能具有更大的转移概率。同时，也要考虑到不同的缓冲液成分留下白环的趋势的差异性，这也取决于有多少润滑剂从聚乙烯薄膜表面转移到缓冲液成分中。