生物制品需氧菌总数，霉菌酵母菌总数标准制定疑问——求微生物老师破解！！！

zhuxudong20

          是不是只要是微生物限度检查都要进行需氧菌总数，霉菌酵母菌总数检测？例如：质量标准需氧菌总数为不大于1cfu/10ml,按中国药典四部1105进行检验。大家认为既然按这个方法进行检验，就必须检验霉菌酵母菌总数。按这个逻辑，注射用水（算药用辅料），那么是不是要检霉菌酵母菌总数？但是，药典标准只有需氧菌总数。

讨论上述问题，我们需要首先理解一下需氧菌总数、霉菌酵母总数的差别：

需氧菌总数检查样品中所有的需氧菌（包括细菌、霉菌和酵母，检测能力经过分析方法验证）；

霉菌酵母菌总数检查供试品中霉菌与酵母菌（可运用选择性培养基或其它方法阻止细菌生长）。

需氧菌总数包含霉菌酵母菌，举个例子来说：药典对于控制需氧菌总数质量标准：X，霉菌酵母总数质量标准：Y，一般为X=10Y，这是科学的。

目前药典微生物限度检查方法既有需氧菌总数也有霉菌酵母总数，导致很多人认为只要是微生物限度检查都需要需氧菌总数、霉菌酵母菌总数检查，其实这是错误的。药典通则1105只是提供方法，具体的标准有单独篇幅说明。微生物检查需要先确定检查菌的类别（需氧菌、霉菌酵母、控制菌等），再选择检验方法，例如《中国药典》二部制药用水（视为药用辅料）药典要求检验微生物限度，但标准只有需氧菌总数要求，方法按《中国药典》四部1105<非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法> 进行检验。再如《中国药典》三部生物制品人胰岛素（原料）药典要求检验微生物限度，但标准只有需氧菌总数要求，方法按《中国药典》四部1105<非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法> 进行检验。值得注意的是GMP指南对无菌工艺生产的产品，除菌过滤前微生物负载需要进行控制，但控制标准也只有需氧菌总数要求（该标准一般为上游产品的标准依据）。

图1.药典指南截图

图2.药典通则截图

图3.药典通则截图

图4.药典通则截图

图5.注射用水药典各论截图

图6.人胰岛素药典各论截图

   以上所有法规与指南都说明，微生物检查先确定需要控制的微生物类别，再选择方法。不是所有微生物限度检查都需要检查需氧菌总数、霉菌酵母菌总数。某些药品控制霉菌酵母菌是因为需氧菌总数标准太大，内含的霉菌酵母菌却不能太多（否则有安全隐患），例如非无菌的中药与固体制剂。

目前存在以下2个问题：

1、       工艺或质量安全（法规）对产品中霉菌酵母菌总数有没有要求？

某些产品由于霉菌和酵母的存在对产品质量或人员安全存在危害，或者中间产品霉菌和酵母的存在会产出真菌毒素或酵母蛋白不利于后期工艺去除与产品质量，则需要控制霉菌酵母。若工艺控制需氧菌总数很严格（例如注射用水的≤10cfu/100ml）即可满足质量安全要求的，是否可不必检查需氧菌总菌数中的霉菌酵母菌总数？

2、       按需氧菌总数与霉菌酵母总数质量标准相当控制（X=Y）。

这个标准制定不科学，若质量安全（法规）或工艺需要控制霉菌酵母，建议将霉菌酵母的标准进行调整（一般为需氧菌总数的1/10）：Y=X/10。例如：需氧菌总数控制为≤10cfu/100ml,则霉菌酵母菌总数也一定是≤1cfu/100ml。生物制品一般较贵重，需氧菌总数标准为≤1cfu/10ml,那么霉菌酵母菌总数标准然后确定？也定≤1cfu/10ml？有什么意义？，或者霉菌酵母菌总数标准为≤1cfu/20ml~100ml?

CDE老师对产品需氧菌总数标准为≤1cfu/10ml认为不够，建议增加霉菌酵母菌总数标准。之前我们有一个CMO项目需氧菌总数≤1cfu/10ml，霉菌酵母菌总数≤1cfu/10ml，单纯的就按药典微生物限度检查法1105进行，需氧菌总数与霉菌酵母菌总数都有质量标准，就通过了。

火舞精灵

首先有质疑精神是值得鼓励的，但是从生物检测的角度分析，有三个概念：无菌检测、微生物限度检测、控制菌检测。从字面上很容易理解，无菌就是不得检出微生物，微生物限度就是控制微生物数量，控制菌就是这个菌不能检出。无菌和控制菌检测这个不用解释了，但是微生物限度有个限度，这个限度就需要思量检测那些微生物，从微生物大小分类而言，细菌与真菌就是需要检测的目标物，至于其他的支原体、衣原体、病毒等之类的则不再考虑。药典中的需氧菌总数在旧版药典中称为细菌总数，但是2015年改版后，TSA培养基适用于药典中的几个标准菌株，和国际接轨修订为需氧菌总数，但鉴于培养温度的区别，真菌在TSA上能检出并不代表是最适合的生长条件，可能会出现漏检的情况，所以SDA也需要加入。纯化水仅检测需氧菌总数是采用的R2A琼脂培养基，是考虑水中的微生物分布进行的，可以参考国外法规，有些试验国内在做但文献不多，国外在生物检测时会考虑本地代表性微生物，国内因为基础性研究较少，加之地大，这一块还有欠缺。

zhuxudong20

谢谢，一上午就您一人敢于发表自己的意见，太感谢了！
TSA是没有选择性的富营养培养基，对大部分需氧嗜温微生物都有较好促生长能力。较之于2010 年版药典的营养琼脂， TSA更丰富的营养物质，增强了培养体系对样品中微生物的复苏能力。 并在培养基适用性愉查中要求TSA 需满足全部细菌和真菌试验菌株的生长需求。
SDA 培养基中葡萄糖占62% ，高糖高渗的环境对细菌有一定的抑制能力， 但并不能完全抑制细菌的生长，用于霉菌酵母就检查当细菌造成需氧菌结果不符合规定时，明确可通过添加抗生素增加培养基对细菌的抑制能力，再点计其菌数。
上述是药典指南原话
我们回归原点，从检验的最初目的与手段发现：经典培养法中，需氧菌是检查微生物的最大负载，霉菌酵母菌检查方法视为选择性检查需氧菌中的部分菌（包括培养温度），而从万一遗漏角度来解释只是担惊受怕的妥协

zlr1779

学习，正需要。

freeer06

zhuxudong20 发表于 2021-12-23 11:33
谢谢，一上午就您一人敢于发表自己的意见，太感谢了！
TSA是没有选择性的富营养培养基，对大部分需氧嗜温 ...

我非常认同你的观点。欧美药典许多原辅料已经很明确用于注射剂只检需氧菌总数，最近正在公示的药包材微生物指导原则也体现了这一理念。

呆呆戴

先收藏，有空细细学习学习

1042379130

学习了，谢谢楼主和各位的分享