【多肽合成】蛋白-蛋白偶联新策略

合肥国肽生物

本周推荐一篇发表在JACS上的文章，文章的通讯作者是来自柏林洪堡大学的Christian P. R. Hackenberger教授，他们课题组主要致力于发展新的偶联方法用于纯蛋白质或是活细胞中蛋白质的功能化修饰。

发展和改进修饰蛋白质的化学方法对于大量生命活动研究以及药理病理学研究来说至关重要。许多蛋白质的偶联策略都是利用亲电小分子去捕获亲核性的半胱氨酸和赖氨酸，或者是利用氧化还原策略去修饰甲硫氨酸，自由基反应修饰色氨酸等等，但在所有氨基酸中，半胱氨酸由于具有特殊的亲核性，所以最常用的试剂是双头亲电试剂二溴马来酰亚胺，二硒酸酯等等，但这些偶联试剂容易生成异质产物，而基于非天然氨基酸插入引入功能性官能团进行偶联，虽然可以有效地避免异质产物的生成，但这种方法需要人为改造蛋白相对来说比较麻烦，目前还有一种策略是通过将亲核氨基酸的侧链残基转化为亲电基团，这种反应性的倒转使得另一个蛋白质中的亲核氨基酸残基或是亲核小分子能够进攻从而发生偶联，这种方法可以简单迅速的产生均质产物，从而满足各种生化过程研究的需求。其中最常使用的是Ellmann's试剂作为亲电试剂，形成由二硫键连接的蛋白-蛋白偶联物，这种方法已经被应用于构建一系列泛素连接蛋白，由于在还原环境中二硫键不稳定所以该方法受到了限制，另一种方法是将半胱氨酸首先转化为脱氢丙氨酸（Dha），进一步可以和巯基反或是利用自由基反应进行偶联。这种方法被应用于构建含有Dha的泛素，从而可以作为活性单针靶向去泛素酶，但是目前还没有报道该方法无可以应用于无相互作用蛋白的偶联，且产生Dha之后的偶联会形成异构体。所以本文作者就开发了一种新的将半胱氨酸的硫醇转化为亲电把手的方法。

作者在前期的工作中发现一种亲电磷试剂，磷酸酰胺可以与叠氮发生staudinger偶联反应生成乙烯基或者炔基磷酸酯，在这个反应中可以在蛋白上引入亲电试剂从而可以后续和巯基发生加成反应进行偶联。由于巯基偶联反应在水相中就有很好的选择性，以及稳定的加成产物可以用于构建订书肽，以及抗体偶联药物。所以作者就猜想是否可以利用利用亲电子的二硫化物，和磷酸酯选择性反应，从而可以将原来实验中的乙烯基磷酸酯变为乙烯基硫代磷酸酯，实现乙烯基的引入以及后续的蛋白偶联。基于此作者开发了一种将半胱氨酸选择性转化为亲电试剂，用于后续产生稳定的蛋白偶联物的新策略，在该方案中，乙烯基磷酸酯可以在酸性条件下可以与蛋白中的半胱氨酸侧链发生选择性地取代反应，生成含有亲电基团乙烯基硫代磷酸酯的蛋白质，进一步可以在native条件下实现蛋白的偶联，作者利用 新方法实现了高产率的单克隆抗体曲妥珠的半胱氨酸修饰，也进一步利用新方法实现了双泛素和泛素-α-突触核蛋白缀合物的构建。

作者在前期的工作中发现一种亲电磷试剂，磷酸酰胺可以与叠氮发生staudinger偶联反应生成乙烯基或者炔基磷酸酯，在这个反应中可以在蛋白上引入亲电试剂从而可以后续和巯基发生加成反应进行偶联。由于巯基偶联反应在水相中就有很好的选择性，以及稳定的加成产物可以用于构建订书肽，以及抗体偶联药物。所以作者就猜想是否可以利用利用亲电子的二硫化物，和磷酸酯选择性反应，从而可以将原来实验中的乙烯基磷酸酯变为乙烯基硫代磷酸酯，实现乙烯基的引入以及后续的蛋白偶联。基于此作者开发了一种将半胱氨酸选择性转化为亲电试剂，用于后续产生稳定的蛋白偶联物的新策略，在该方案中，乙烯基磷酸酯可以在酸性条件下可以与蛋白中的半胱氨酸侧链发生选择性地取代反应，生成含有亲电基团乙烯基硫代磷酸酯的蛋白质，进一步可以在native条件下实现蛋白的偶联，作者利用 新方法实现了高产率的单克隆抗体曲妥珠的半胱氨酸修饰，也进一步利用新方法实现了双泛素和泛素-α-突触核蛋白缀合物的构建。

文章地址：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.0c03426

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