请教，2015版药典微生物限度方法验证问题（如何加菌）

guanlingling

关于微生物方法验证菌液加入问题有几点疑问，请大家帮忙！
2015版药典微生物方法验证，1.供试组  取制备好的供试液，加入试验菌，混匀，使每1ml供试液或每张滤膜所滤过的供试液中含菌量不大于100cfu。2.所加菌液的体积应不超过供试液体积的1%。
以上两个条件的前提下，操作步骤有一些疑问。
1、如果是平板法，在制备菌液和各供试品混合液时，如何操作？
    首先取供试品10g（以固体为例），加100ml稀释剂溶解。分取供试液5份，每份10ml。每一份中加“金、绿、枯、白、黑”一种菌。按照“所加菌液的体积应不超过供试液体积的1% ”的要求，每份中加菌量不超过0.1ml。按照“使每1ml供试液或每张滤膜所滤过的供试液中含菌量不大于100cfu”的要求，平板法供试品取1ml，每一份10ml中应该含有1000cfu菌。也就是说加入的0.1ml菌应含有1000cfu，也就是加入的菌液浓度为10000CFU/ml（4次方）。这样操作可以吗？如果这样操作，菌液对照组是否将10000（4次方）菌液稀释为100cfu/ml？
2、如果膜过滤法。
2.1如果每膜需过滤1:10供试液1ml。是否按照上述平板法一样先用10ml供试液（1:10）混合各4次方的菌后再加入稀释液过滤。
2.2可否可以如下操作（以一种菌为例）：取1:10供试液1ml（或10ml），加入100ml稀释液中，再加入1ml含100cfu/ml菌。然后全部过膜。这样就是把供试液体积先稀释成100ml以上，再加入1%体积的菌（1ml）。这种方法操作上比较容易，但不知道是否违背上述红色字体的两种条件。概念上有些牵强。
    以上是个人的理解，请大家帮忙分析，指正。希望有更合理的操作方法分享。谢谢！！！

孙艳红

对于如何加你的操作规程写的会很明白，按照操规执行就行了

guanlingling

fsyylf 发表于 2014-6-11 12:09
对于如何加你的操作规程写的会很明白，按照操规执行就行了

重新方法学验证阶段，只是设计方法。还没有到编写操作规程。

歪说歪有李

收藏，坐等牛人解决 @咕咕  @静夜思雨

咕咕

没仔细研究2015版药典要求，菌液加入方式变了？
若菌含量要达到10000cfu/ml不是有点麻烦？

普子

咕咕 发表于 2014-6-25 16:03
没仔细研究2015版药典要求，菌液加入方式变了？
若菌含量要达到10000cfu/ml不是有点麻烦？

加入10-4的

普子

我看方法可以，没问题的。

红茶.

怎么确定这个小于100cfu呢

静夜思雨

又是玩的文字游戏。我目前还没有看到15版药典，按上面描述的意思就是加入10的-4次方浓度的菌液。但是在实际操作过程中，有的菌10的-4会超过100cfu/ml。甚至要进一步稀释至10的-5或-6次方。

张必府

对于第一点：你这样做没有问题，一般是9.9ml加0.1ml菌液制成10ml，满足不超过1%加菌量的要求，菌液组直接移取1ml小于100cfu的菌液来做。
对于第二点：当采用薄膜过滤法来做时，USP1117建议在最后一次冲洗的时候加菌。但我觉得你这样做其实挺聪明的。

randaye12

我觉得方法可行。

guanlingling

谢谢大家的回复。还有哪位老师有更好的想法可以互相学习。

ylh0811

如何确定我加进去的菌落就是小于100cfu，把菌液先计数培养后再用菌液？但是菌液保存时间是24h内使用？如何保证菌液就是小于100cfu？

hyuanlin

ylh0811 发表于 2015-7-28 11:23
如何确定我加进去的菌落就是小于100cfu，把菌液先计数培养后再用菌液？但是菌液保存时间是24h内使用？如何保 ...

同感，求回复

zhaosong0404

药典的理解很关键，就怕理解错呀

畅畅妈妈

问题1：2010版三部中关于无菌检查中提到：“阳性对照也可在供试品无菌检查培养14天后，取其中1份硫乙醇酸盐流体培养基，加入小于100CFU阳性对照菌，作为阳性对照。”而2015版药典四部无菌检查中取消了此项说明，那作为生物制品生产企业的我们，在做无菌检查时是否仍然能够无菌检查培养14天后再做阳性对照吗？ 问题2:2010版药典微生物限度检查中提到：“验证试验至少应进行3次独立的平行试验”，而2015版通则里则没有此句说明。应该怎么理解这个变化，我们企业做方法适用性试验时应该怎么操作，是每个品种选三批验证，还是一批做三次验证，或一批一次验证也可以呢？